|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОМА SACCHOROMYCES CEREVISIAE ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ САМОСБОРКИ ВИРУСПОДОБНЫХ ЧАСТИЦдипломная работа (Магистр)
- Научные руководители: Ким Александр Иннокентьевич, Муха Дмитрий Владимирович
- Автор: Тагирова Алина Ильмировна
- Тип: Магистр
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Год защиты: 2023
- Аннотация: Вирусоподобные частицы (ВПЧ) представляют собой капсиды вирусов, не содержащие генетического материала, и, следовательно, не способные к инфицированию. В современной медицине ВПЧ востребованы как безопасные и высокоэффективные средства диагностики, лечения и профилактики большого количества различных заболеваний человека. Важнейшими направлениями исследований с использованием ВПЧ являются получение вакцинных препаратов нового поколения и разработка систем направленной доставки лекарственных препаратов в конкретный тип клеток организма человека. Характерными особенностями ВПЧ служат небольшой размер, регулярность структуры, стабильность и устойчивость капсида, возможность модификации структуры капсида, простота и финансовая доступность их получения. Для успешного применения ВПЧ в медицине, важно понимать не только фундаментальные основы самосборки ВПЧ различных вирусов, но и исследовать особенности этого процесса в различных гетерологичных системах, которые применяются для их продукции (клетки дрожжей, растений, насекомых, млекопитающих) и выявлять факторы, влияющие на этот процесс. Необходимо проводить поиск гетерологичных систем, которые позволили бы получить наибольший выход ВПЧ, и которые были бы наиболее просты в применении. На данный момент дрожжевые экспрессионные платформы, особенно получаемые на основе Saccharomyces cerevisiae, являются наиболее предпочтительными благодаря таким преимуществам, как быстрый рост биомассы, наличие посттрансляционных модификаций белкового продукта, высокий выход экспрессируемых белков, масштабируемость, экономически эффективное производство. Дрожжи используются в качестве модели для изучения формирования ВПЧ широкого спектра вирусов, их часто применяют для производства вакцин. Однако, несмотря на обширную базу данных об особенностях физиологии и клеточной биологии этих организмов-продуцентов, эффективность производства ВПЧ зависит от многих факторов, требующих дальнейшего изучения. Очевидно, что создание новой экспрессионной системы для эффективного производства ВПЧ невозможно без использования современных методов генетической и белковой инженерии. В настоящее время особую популярность приобретают методы редактирования генома, позволяющие 1) изменять структуру заданных генов, обуславливая их инактивацию, и 2) интегрировать в заданные участки генома протяженные фрагменты ДНК, в частности, чужеродные гены. Представленное исследование посвящено оптимизации экспрессии капсидного белка VP3 денсовируса рыжего таракана, слитого с желтым флуоресцентным белком YFP, в гетерологичной системе – клетках дрожжей S.cerevisiae. Изучаемый нами вирус - Blattella germanica densovirus 1 (BgDV1) - представитель подсемейства Densovirinae. Важной особенностью денсовирусов служит возможность сборки вирусоподобных частиц из каждого капсидного белка в отдельности. Капсид BgDV1 представляет собой икосаэдр размером 20 нм и состоит из трех белков (VP1, VP2, VP3), которые имеют молекулярную массу 100, 85/80 и 56 кДа, соответственно. Белки капсида BgDV1 имеют общую последовательность, соответствующую целому белку VP3, в то время как белки VP1 и VP2 характеризуются наличием уникальных N-концевых участков (Kapelinskaya et al., 2011). Ранее в нашей лаборотории было показано формирование ВПЧ на основе самосборки капсидного белка VP3 BgDV1, слитого с небольшой эпитопной последовательностью (68 аа) при экспрессии белка в клетках дрожжей S. cerevisiae. Кроме того, были получены слитые с YFP белки VP3 BgDV1, содержащие нативный и мутантный сигнал ядерной локализации (NLS). Было показано, что мутация в NLS приводит к изменению внутриклеточной локализации белкового продукта. Несмотря на достигнутый прогресс, оставалось не ясным, какие именно молекулярные механизмы обуславливают особенности внутриклеточной локализации белкового продукта в клетках дрожжей. Было выдвинуто предположение, что ключевую роль играет убиквитинирование белкового продукта. Целями представленной работы являлись: 1) Оптимизировать экспрессионную систему для самосборки вирусоподобных частиц в клетках дрожжей S. cerevisiae. 2) Исследовать влияние убиквитинирования на внутриклеточную локализацию экспрессируемого капсидного белка, слитого с YFP, методами флуоресцентной микроскопии. Для достижения целей работы были поставлены следующие задачи: 1) Методами редактирования генома (CRISPR/Cas9), инактивировать в используемом штамме дрожжей два целевых гена, а именно, гены Pep4 и Gal80. 2) Методом сайт-направленного мутагенеза получить серию генетических конструкций, содержащих ген флуоресцентного белка, слитого с различными вариантами гена VP3 BgDV1, несущих мутации в сайтах убиквитинирования и/или прерывающих трансляцию в заданных сайтах. Исследовать внутриклеточную локализацию экспрессируемых белков в клетках S. cerevisiae.
- Добавил в систему: Ким Александр Иннокентьевич