Влияние длины 5’-НТО и концентрации факторов инициации eIF1 и eIF5 на эффективность трансляции репортерных мРНК с разным контекстом стартового кодона - курсовая работа | ИСТИНА – Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных

Научный руководитель: Дмитриев С.Е.
Автор: Полянская Софья Алексеевна
Тип: Специалист
Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
Кафедра: Кафедра молекулярной биологии
Год защиты: 2014
Курс: 4
Аннотация: Выбор стартового кодона при инициации трансляции у эукариот – это сложный многостадийный процесс. Его результат для каждой конкретной мРНК определяется как цис-, так и транс-действующими факторами и подвержен тонкому регулированию. К цис- действующим факторам относятся прежде всего локальный нуклеотидный контекст AUG- кодона и расстояние от него до 5’-конца мРНК. Транс-действующие компоненты – это факторы инициации трансляции, в первую очередь – eIF1 и eIF5, которые контролируют процесс узнавания AUG-кодона антикодоном инициаторной Мет-тРНК в составе сканирующего комплекса. До недавнего времени было принято считать, что вероятность узнавания AUG-кодона возрастает в ряду, выведенном Мэрилин Козак ещё в 80-е годы прошлого века (Kozak, 1987): от «слабого» контекста YRRAUGY к «сильному» RYYAUGR, и что влияние нуклеотидной композиции за пределами области -3...+4 минимально. Бесспорным казался также тот факт, что уменьшение расстояния от 5’-конца до AUG-кодона до 20 нт и меньше способствует «проскальзыванию» этого AUG (Kozak, 1989). Однако в 2008 году в лаборатории Ривки Дикштайн была выполнена работа, согласно которой нуклеотидный контекст AAGAUGGCGGC (т.н. TISU-контекст) делал инициацию с AUG-кодона очень эффективной и не зависящей от укорочения 5’-нетранслируемой области (Elfakess & Dikstein, 2008). Данная последовательность очень распространена в 5’-проксимальных частях мРНК по той причине, что на уровне ДНК консенсус SAASATGGCGGC представляет из себя, по- видимому, один из вариантов сайта связывания транскрипционного фактора YY1. Этот фактор помечает точку начала транскрипции в тысячах генов млекопитающих. В работе 2011 года та же группа показала, что инициация трансляции в данном контексте не чувствительна в увеличению концентрации фактора eIF1 при трансляции в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика (что может указывать на неканонический характер узнавания AUG- кодона). Нас заинтересовал молекулярный механизм этого явления, тем более что в лаборатории уже имелся опыт изучения трансляции мРНК с ультракороткими 5’-НТО (Andreev et al., 2006; Dmitriev et al., 2010). Поскольку в нашей лаборатории налажена система сборки трансляционных комплексов из очищенных компонентов, то мы могли бы напрямую изучить механизм влияния отдельных факторов на выбор стартового триплета на данных мРНК. O6 Однако прежде чем браться за такой проект, необходимо было удостовериться, что описанный коллегами эффект воспроизводится в тех системах, которые мы считаем наиболее приближенными к ситуации in vivo: в бесклеточной системе из клеток асцитокарциномы мыши и методом кратковременной РНК-трансфекции культивируемых клеток человека. Это и стало целью данного исследования. В работе были поставлены следующие задачи: 1. Определить влияние длины 5’-НТО (5 или 30 нт) на эффективность инициации трансляции искусственной мРНК, кодирующей люциферазу светлячка, с тремя разными контекстами AUG-кодона («сильным» козаковским, «слабым» козаковским и TISU) в бесклеточной системе из асцитокарциномы мыши и в культивируемых клетках HEK293T (при кратковременной РНК-трансфекции); 2. Выяснить эффект добавления разных концентраций рекомбинантных белков eIF1 и eIF5 на уровень трансляции тех же РНК- конструкций в бесклеточной системе из клеток асцитокарциномы мыши.
Добавил в систему: Дмитриев Сергей Евгеньевич

	ИСТИНА	Войти в систему Регистрация
	ИСТИНА ИНХС РАН
	Главная Поиск Статистика О проекте Помощь

ИСТИНА

ИСТИНА ИНХС РАН

Прикрепленные файлы