Определение кинетических параметров гидролиза синтетического субстрата Abz-FRK(Dnp)P-OH под действием ангиотензин-I-превращающего ферментакурсовая работа (Специалист)
Аннотация:Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ) – цинк-зависимая пептидаза, выполняющая
множество важных функций в организме, главная из которых - регуляция артериального
давления. АПФ содержит два домена в составе одной полипептидной цепи (N- и C-), в
каждом из которых находится активный центр. АПФ является интегральным мембранным
белком I типа и выполняет основные функции будучи закрепленным на клеточной
мембране на поверхности эндотелиальных, эпителиальных, нейроэпителиальных клеток,
а также клеток иммунной системы (макрофагов и дендритных клеток) Под действием
специальной секретазы возможен переход его из мембраносвязанного состояния в
растворимое путем расщепления полипептидной цепи в примембранной области,
называемое шеддингом. Растворимая форма АПФ без мембранного якоря содержится в
крови, семенной жидкости и других биологических жидкостях организма. Содержание
АПФ в семенной жидкости в 50 раз выше, чем в крови человека. В кровь человека АПФ
поступает в основном из эндотелиальных клеток капилляров легких, тогда как АПФ в
семенной жидкости происходит из эпителиальных клеток эпидидимиса и предстательной
железы. Активность АПФ в биологических жидкостях является важным клиническим
параметром различных заболеваний. Его отклонение от нормы является сигналом о
возможном наличии патологий, таких как бронхиальная астма, саркоидоз и болезнь Гоше.
Целью данной работы является выделение и характеристика соматической формы АПФ из
гомогената ткани легких человека и определение кинетических параметров гидролиза
одного из FRET-субстратов, а именно: N -ортоаминобензоил-L-фенилаланил-L-аргинил-
(N ω -2,4-динитрофенил)-лизил-пролин (Abz-FRK(Dnp)P-OH) (FRK), под действием
выделенного АПФ человека с целью дальнейшего сопоставления полученных данных с
результатами.
Работа проводилась в соответствии с Кодексом этики Всемирной медицинской
ассоциации (Хельсинкская декларация) и была одобрена Институциональным
наблюдательным советом Центра сердечно-сосудистой хирургии им. Бакулева и МГУ
имени М.В. Ломоносова. В качестве источника АПФ использовали гомогенат ткани легкого
человека объемом 800 мл (200 г ткани к 600 мл PBS). Фермент очищали с помощью
аффинной хроматографии и концентрировали до конечного объема 1,5-2 мл на 100 кДа
фильтрах Vivaspin-500. Гомогенность полученных препаратов подтверждена
электрофорезом. Концентрация белка в конечном препарате определена по методу
Лоури. Активность АПФ измеряли флуориметрическим методом с использованием 2 мМ
Z-Phe-His-Leu в качестве субстрата. Очищенный активный препарат хранили при +4˚С.
Таким образом, нами получен очищенный препарат соматического АПФ из легочной
ткани человека. Определена концентрация белка (0,2 мг/мл), удельная активность (6,726
мкМ/мин). Концентрация легочного АПФ в полученных препаратах составила от 1,1 мкМ.
Определены кинетические параметры ферментативного гидролиза, k cat и K M , субстрата с
внутренним тушением флуоресценции Abz-FRK(Dnp)P-OH под действием АПФ из легких
человека: k cat =(34±3) c -1 , K M =(13±1) мкМ при рН=7,5 и 25°С.