|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Определение кинетических параметров гидролиза синтетического субстрата Abz-FRK(Dnp)P-OH под действием ангиотензин-I-превращающего ферментакурсовая работа (Специалист)
- Научный руководитель: крюкова ольга владимировна
- Автор: Глазкова Екатерина Владимировна
- Тип: Специалист
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Кафедра: Кафедра химической энзимологии
- Год защиты: 2021
- Курс: 4
- Аннотация: Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ) – цинк-зависимая пептидаза, выполняющая множество важных функций в организме, главная из которых - регуляция артериального давления. АПФ содержит два домена в составе одной полипептидной цепи (N- и C-), в каждом из которых находится активный центр. АПФ является интегральным мембранным белком I типа и выполняет основные функции будучи закрепленным на клеточной мембране на поверхности эндотелиальных, эпителиальных, нейроэпителиальных клеток, а также клеток иммунной системы (макрофагов и дендритных клеток) Под действием специальной секретазы возможен переход его из мембраносвязанного состояния в растворимое путем расщепления полипептидной цепи в примембранной области, называемое шеддингом. Растворимая форма АПФ без мембранного якоря содержится в крови, семенной жидкости и других биологических жидкостях организма. Содержание АПФ в семенной жидкости в 50 раз выше, чем в крови человека. В кровь человека АПФ поступает в основном из эндотелиальных клеток капилляров легких, тогда как АПФ в семенной жидкости происходит из эпителиальных клеток эпидидимиса и предстательной железы. Активность АПФ в биологических жидкостях является важным клиническим параметром различных заболеваний. Его отклонение от нормы является сигналом о возможном наличии патологий, таких как бронхиальная астма, саркоидоз и болезнь Гоше. Целью данной работы является выделение и характеристика соматической формы АПФ из гомогената ткани легких человека и определение кинетических параметров гидролиза одного из FRET-субстратов, а именно: N -ортоаминобензоил-L-фенилаланил-L-аргинил- (N ω -2,4-динитрофенил)-лизил-пролин (Abz-FRK(Dnp)P-OH) (FRK), под действием выделенного АПФ человека с целью дальнейшего сопоставления полученных данных с результатами. Работа проводилась в соответствии с Кодексом этики Всемирной медицинской ассоциации (Хельсинкская декларация) и была одобрена Институциональным наблюдательным советом Центра сердечно-сосудистой хирургии им. Бакулева и МГУ имени М.В. Ломоносова. В качестве источника АПФ использовали гомогенат ткани легкого человека объемом 800 мл (200 г ткани к 600 мл PBS). Фермент очищали с помощью аффинной хроматографии и концентрировали до конечного объема 1,5-2 мл на 100 кДа фильтрах Vivaspin-500. Гомогенность полученных препаратов подтверждена электрофорезом. Концентрация белка в конечном препарате определена по методу Лоури. Активность АПФ измеряли флуориметрическим методом с использованием 2 мМ Z-Phe-His-Leu в качестве субстрата. Очищенный активный препарат хранили при +4˚С. Таким образом, нами получен очищенный препарат соматического АПФ из легочной ткани человека. Определена концентрация белка (0,2 мг/мл), удельная активность (6,726 мкМ/мин). Концентрация легочного АПФ в полученных препаратах составила от 1,1 мкМ. Определены кинетические параметры ферментативного гидролиза, k cat и K M , субстрата с внутренним тушением флуоресценции Abz-FRK(Dnp)P-OH под действием АПФ из легких человека: k cat =(34±3) c -1 , K M =(13±1) мкМ при рН=7,5 и 25°С.
- Добавил в систему: Крюкова Ольга Владимировна