|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Получение молекулярно-генетических конструкций для продукции рекомбинантного белка PA2G4 человека в бактерияхкурсовая работа (Специалист)
- Научный руководитель: Дмитриев С.Е.
- Автор: Музалевская Юлия Андреевна
- Тип: Специалист
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Кафедра: Факультет биоинженерии и биоинформатики
- Год защиты: 2024
- Курс: 2
- Аннотация: IRES-элементы (англ. Internal Ribosome Entry Site) – это регуляторные участки вирусных РНК, обеспечивающие их кэп-независимую трансляцию. Как правило, они располагаются в 5'-нетранслируемых областях или в межгенных спейсерах полицистронных мРНК. IRES-элементы привлекают трансляционный инициаторный комплекс независимо от наличия 5'-концевого m7G-кэпа в мРНК и одновременно обеспечивают конформационные изменения малой субчастицы рибосомы, позволяющие ей разместить внутреннюю область мРНК в мРНК-связывающем канале. Благодаря этому становится возможна внутренняя кэп-независимая инициация трансляции. Некоторым IRES-элементам для эффективной работы, помимо канонических факторов инициации, необходимы специфичные клеточные РНК-связывающие белки, так называемые ITAF (англ. IRES trans-acting factors), которые не участвуют в обычной кэп-зависимой инициации. Вероятно, ITAF служат в качестве РНК-шаперонов, связываясь с несколькими доменами РНК и стабилизируя весь IRES в конфигурации, подходящей для связывания канонических факторов инициации и, в конечном счете, рибосом. В литературе показано, что для формирования 48S инициаторного комплекса IRES-элементу вируса ящура (FMDV, англ. foot-and-mouth disease virus) необходим клеточный белок ITAF45/PA2G4. Было замечено, что существуют две изоформы белка PA2G4 – размером 48 кДа («p48») и 42 кДа («p42»). В мРНК FMDV имеются два стартовых кодона (AUG1 и AUG2), находящиеся в одной рамке считывания. PA2G4 необходим для инициации трансляции с обоих из них. Мы решили выяснить, нет ли дифференциального влияния изоформ р42 и р48 на FMDV-зависимую трансляцию с AUG1 и/или AUG2 в in vitro системе на основе лизатов клеток, нокаутных по гену PA2G4. Для изучения функций белка PA2G4 необходимо было получить молекулярно-генетические конструкции для продукции рекомбинантного белка в бактериях. В настоящей работе было проведено клонирование генов изоформ p42 и p48 PA2G4, изначально находившихся в векторе для экспрессии в клетках млекопитающих, в бактериальный экспрессионный вектор pET-28b. Правильность полученных конструкций была подтверждена методами ПЦР, а также с помощью рестрикционного анализа и секвенирования. Список литературы 1. Сорокин и др., Биохимия, 2021, 86(9), 1273-1313. 2. Pilipenko et al., Genes Dev, 2000, 14(16), 2028-2045. 3. Andreev et al., RNA, 2007, 13(8), 1366-1374
- Добавил в систему: Дмитриев Сергей Евгеньевич