Определение констант диссоциации комплексов мутантных форм интегразы вируса иммунодефицита человека I типа с ДНК-субстратомкурсовая работа (Специалист)
Аннотация:На сегодняшний день одной из важнейших задач научного сообщества является поиск эффективных методов борьбы с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-1). В состав ВИЧ входит множество структурных и функциональных белков, среди которых особую роль играет интеграза. Она катализирует реакцию встраивания вирусного генома в геном клетки-хозяина, и, поскольку для репликации вируса процесс интеграции играет чрезвычайно важную роль, разработка новых компонентов противовирусной терапии ведется именно в направлении ингибирования интегразы. Однако данных о самом ферменте на текущее время явно недостаточно. Отсутствуют рентгеноструктурные сведения о строении как интегразы в целом, так и её комплексов с ДНК. Это в первую очередь связано со сложностью кристаллизации, коагуляционной неустойчивостью, возможностью функционирования в виде мультимера. Поэтому направленный мутагенез становится эффективным методом изучения строения как самой интегразы, так и комплексов на её основе.
Хорошо изучено влияние мутаций в каталитическом домене интегразы на её активность. Однако влияние замены аминокислот, не входящих в активный центр интегразы, но аллостерически участвующих в связывании цепи ДНК, изучено недостаточно.
Методами компьютерного моделирования в нашей лаборатории было показано существование в интегразе белковой «петли», участвующей в связывании ДНК (выделена на Рис. 1). На модели видно, что аминокислоты в этом фрагменте могут образовывать белок-белковые (Asp 229) и ДНК-белковые (Asp 232) связи. Мы решили изучить влияние замен аминокислотных остатков, которые, по нашему мнению, могут влиять на некоторые внутри- и межмолекулярные взаимодействия и характеристики связывания субстрата мутантной интегразой. В настоящей работе было определено влияние замены аспарагиновой кислоты (D) в положениях 229 и 232 на аланин (А) методами поляризации флуоресценции, «торможения в геле», сравнения кинетических зависимостей.