ИСТИНА

В ходе данной работы было показано, что сложности в реконструкции инициирующих комплексов на таких мРНК определяются наличием в их 5’-НТО вторичных структур, причём даже незначительное количество спаренных GC-оснований приводит к заметному снижению выхода 48S-комплекса. Было проведено исследование с использованием модельных конструкций, показавшее, что наличие в 5’-лидерах мРНК незначительных вторичных структур резко повышает требования к концентрации фактора инициации eIF4B, который, будучи очищен до гомогенного состояния, становится очень нестабильным и быстро теряет активность даже при хранении в глубокой заморозке, чем и объяснялись предыдущие неудачи в реконструкции. У таких матриц также наблюдались повышенные требования к факторам eIF4F, eIF4A и eIF2. С учётом этих данных начальная методика реконструкции 48S-комплексов из очищенных компонентов была модифицирована, в результате чего впервые удалось добиться сборки 48S на кеп-зависимых мРНК со структурированными 5’-НТО и продемонстрировать правильность положения 40S субчастицы на AUG-кодоне методом тоу-принтинга. Другая часть работы была посвящена применению метода тоу-принта для анализа различий между 48S и 80S инициирующими комплексами. Было обнаружено, что картины тоу-принтов от 48S и 80S комплексов как в лизате ретикулоцитов кролика, так и в системе реконструкции из очищенных компонентов различаются, что позволило изучить накопление комплексов в лизате под действием разных антибиотиков, обнаружить паузу в переходе 48S в 80S и проанализировать распределение комплексов на трёх AUG-кодонах мРНК вируса энцефаломиокардита.