ИСТИНА

Актуальность темы исследования Сахарный диабет типа 2 представляет собой серьёзную медико-социальную проблему, значимость которой обусловлена его высокой распространенностью, хроническим течением, высоким уровнем инвалидизации и смертности больных в результате развития поздних сердечно-сосудистых осложнений и дисфункции эндотелия, а также необходимостью создания системы специализированной помощи больным (Аметов А.С., 2014). По данным ВОЗ, сахарный диабет увеличивает смертность в 2—3 раза и сокращает продолжительность жизни. При этом заболеваемость ежегодно увеличивается во всех странах на 5-7%, а каждые 12-15 лет – удваивается (Дедов И.И., 2011; Петров В.И., 2013). Одно из направлений поиска – циклические гуанидины. (Valerie A., 2000; Scott D. Larsen., 2001; Fumiyoshi Ishikawa, 1978). Учитывая, что производные гуанидина, в частности метформин является золотым стандартом современной фармакотерапии сахарного диабета, интенсивно проводятся исследования для создания на базе гуанидинов новых лекарственных средств. Ранее проводились исследования на кафедре фармакологии ВолгГМУ совместно с НИИ физической и органической химии Южного федерального университета, которые показали, что среди этих веществ есть соединения с высокой гипогликемической активностью. Вследствие этого, направленный поиск позволит найти активные вещества среди новых производных циклических гуанидинов. Несмотря на значительные достижения современной антидиабетической фармакотерапии отмечаются различные формы устойчивости к назначаемым препаратам, со сложным генезом развития побочных эффектов (Стаценко М.Е., 2015; Mazzi R., 2007; Недогода С.В., 2015).Стадийность и особенности генеза сахарного диабета сказываются на развитии резистентности к лекарственным препаратам, либо оказывают большое количество отрицательных эффектов (Drucker D.J., 2006;Тюренков И.Н., 2008). В существующем многообразии лекарственных препаратов, применяемых в клинике, не существует препарата, влияющего на патогенетические звенья сахарного диабета, кроме того длительная терапия любым из существующих препаратов приводит к развитию толерантности, поэтому целесообразность создания новых высокоэффективных и низкотоксичных препаратов остается актуальной. В настоящее время существует два подхода к поиску новых веществ с гипогликемической активностью: оптимизация структуры известных лекарственных препаратов для снижения токсичности и увеличение эффективности (Зефирова О. Н., 2000) и мишень-ориентированный поиск (Спасов А.А., 2013). В данной работе разработана система ретроспективного и проспективного прогноза, позволившая провести анализ существующих баз данных по структуре и активности соединений для поиска новых эффективных гипогликемических веществ. Степень научной разработанности проблемы Производные гуанидина с прошлого столетия привлекают внимание в качестве основы создания препарата для лечения сахарного диабета. Один из препаратов данной группы, используемый в клинической практике – метформин, который по последним данным является активатором АМК-киназы (Carling, D., 2004; DeSimone 2004), что вероятно, и определяет его мультитаргетность и плейотропность действия. В этой связи, не меньший интерес вызывают и другие гуанидины, в частности, циклические гуанидины (Valerie A., 2000; Scott D. Larsen., 2001; Спасов А.А, 1999; Fumiyoshi Ishikawa, 1978). В ВолгГМУ совместно с НИИ ФОХ ЮФУ инициировались попытки поиска гипогликемических соединений гуанидинсодержащих структур, на основе конденсированных амибензимидазолов, в узких гомологических рядах (Анисимова, 1995). Были выявлены активные вещества, которые по силе гипогликемического действия не уступали препаратам сравнения (метформин, глибенкламид) (Дудченко Г.П., 1996). В настоящее время создан банк данных производных циклических гуанидинов, более 1000 соединений. В связи с этим, очевидно важным является проведение анализа перспективности на гипогликемическую активность препаратов из банка данных и углубленное изучение их фармакологических свойств. Целью настоящего исследования является разработка системы направленного поиска среди нового класса – циклических гуанидинов, соединений с гипогликемической активностью; изучение антидиабетогенного механизма действия наиболее активных веществ; проведение комплекса доклинических испытаний наиболее перспективных соединений с антидиабетическими свойствами. Задачи исследования: 1. Теоретическое и экспериментальное обоснование перспективности нового класса «привилегированных молекул» – циклических гуанидинов как источника веществ с высокой гипогликемической активностью. 2. Создание системы направленного поиска in silico новых эффективных гипогликемических соединений среди производных циклических гуанидинов - конденсированных бензимидазолов на основе 2D- и 3D-QSAR технологий, методов 3D-молекулярного моделирования и докинга в релевантные белки-мишени, с использованием баз данных по структуре и активности известных гипогликемических лекарственных веществ и новых испытанных соединений. 3. С применением разработанной системы компьютерного поиска и экспериментальных методик, проведение многоэтапного итеративного скрининга циклических гуанидинов, обладающих гипогликемическими свойствами, с отбором соединений-лидеров для дальнейших углубленных испытаний. 4. С использованием методов 3D-молекулярного моделирования и методов докинга в релевантные белки-мишени проведение анализа in silico возможных механизмов действия наиболее активных веществ. 5. Изучение гипогликемической активности исследуемых веществ на интактных животных, а также при моделировании экспериментального сахарного диабета типа 2 (стрептозотоциновый сахарный диабет) при курсовом введении. 6. Изучить влияние соединения диабенол на структуру островков Лангерганса и секрецию инсулина (на количество С-пептида). 7. Изучить инкретиномиметический эффект диабенола (субстанция и гранулята таблеток). 8. Исследовать механизм гипогликемического действия диабенола (субстанция и гранулята таблеток) при сахарной нагрузке на компоненты углеводного обмена (гликоген печени, мышц, молочная кислота, пируват), на скорость гликолиза и гликогенолиза, на количественное содержание гликозилированного гемоглобина и на количество С-пептида в плазме крови. 9. Исследовать влияние диабенола на реологические свойства крови in vitro и in vivo, и на тромбогенный потенциал крови в условиях экспериментальной патологии. Научная новизна Впервые создана система направленного поиска in silico нового класса - производных циклических гуанидинов с гипогликемической активностью, основанная на консенсусе прогнозных оценок, полученных несколькими методами (система PASS, ИТ «Микрокосм», подструктурный анализ, частотный анализ физико-химических свойств, ADMET). Впервые выполнен анализ in silico механизма антидиабетического действия высокоактивного вещества класса циклических гуанидинов. Впервые проведено изучение in silico основных фармакокинетических, фармакодинамических, токсических свойств наиболее активных производных циклических гуанидинов. Впервые изучено влияние диабенола на активность следующих белков мишеней, регулирующих углеводный обмен: PYGLCat; JAK2 inh; PARP1; PDK4; MGAMAGlu; HK-4; AMPK; PPARg agon; HK-4 activ; FBP1; PTP1B и AMPK. Впервые показано (in silico, in vitro и in vivo) отсроченное ингибирование фермента дипептидилпептидазы–4 (ДПП–4) диабенолом при курсовом введении. Впервые изучена эффективность лекарственной формы в сравнении с субстанцией при курсовом введении. Показано, что лекарственная форма, как и субстанция, увеличивает секрецию инсулина, снижает гликемию, скорость гликолиза и гликогенолиза, а также повышает гликоген в печени. Кроме этого, наблюдалось снижение вязкости и тромбогенного потенциала крови. Впервые изучен механизм гипогликемического действия твердой лекарственной формы диабенола. Научно-практическая значимость Создан банк данных производных циклических гуанидинов проявляющих гипогликемическую активность. В результате выявленных закономерностей между гипогликемической активностью производных бензимидазола (встроенных циклических гуанидинов) и их химической структурой разработана система поиска с использованием нескольких информационных технологий компьютерного прогноза для выявления наиболее значимых веществ, проявляющих гипогликемические свойства. Определены перспективные базовые структуры для поиска и последующего изучения новых лекарственных веществ. Полученные экспериментальные данные позволяют проводить направленный поиск гипогликемических веществ среди циклических гуанидинов. Доказано, что эффективность лекарственной формы не уступает субстанции, что является доказательством целесообразности проведения клинических исследований. Комплексное исследование фармакологических и токсических свойств наиболее эффективных соединений позволяет наметить перспективы по созданию на их основе лекарственных препаратов с оригинальным механизмом действия для лечения сахарного диабета типа II. Методология и методы исследования Исследование носило комплексный характер, предполагающий сочетание экспериментальных исследований in vivo и разработанной системы компьютерного поиска и экспериментальных методик проведение многоэтапного итеративного скрининга циклических гуанидинов, обладающих гипогликемическими свойствами, с отбором соединений-лидеров для дальнейших углубленных испытаний. Экспериментальные исследования выполнены с использованием достаточного количества лабораторных животных (крысах линии wistar, белых беспородных крысах, мышах и кроликов-самцах породы «Шиншилла») и в соответствии с методическими рекомендациями по доклиническому изучению лекарственных средств (Миронов, 2012), а также с использованием современных информативных методов, имеющихся в распоряжении в НИИ фармакологии ВолгГМУ и ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» МЗ РФ (ВолгГМУ). Использованы методы in silico для поиска нового класса химических веществ с высокой гипогликемической активностью, основанные на консенсусе прогнозных оценок, полученных несколькими методами (система PASS, ИТ «Микрокосм», подструктурный анализ, частотный анализ физико-химических свойств, ADME), позволяющие достоверно провести прогноз и выявить значимые признаки циклических гуанидинов с высокой гипогликемической активностью. Для статистической обработке результатов экспериментов проводили в пакете прикладных программ «Statistica 6.0» (StatSoft, США) с использованием стандартных параметрических и непараметрических методов. Все исследования были одобрены Региональным независимым этическим комитетом, протокол №135-2011 от 06.05.2011г. Реализация результатов исследования. Выявленные закономерности между гипогликемическим видом активности циклических гуанидинов и их химической структурой, используются при синтезе новых веществ в НИИ Физической и органической химии Южного федерального университета (г. Ростов-на-Дону). Методологические подходы к изучению антидиабетической активности циклических гуанидинов используются при проведении исследований в лаборатории экспериментальной фармакологии ВМНЦ, НИИ фармакологии и кафедр фармакологии, фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета. Результаты работы внедрены в лекционные курсы кафедры фармакологии Саратовского государственного медицинского университета, кафедры фармакологии Пермской государственной медицинской академии, кафедрах фармакологии, фармакологии и биофармации ФУВ, фармацевтической и токсикологической химии Волгоградского государственного медицинского университета, кафедре фармакологии с курсом клинической фармакологии Пятигорского медико-фармацевтического института – филиала Волгоградского государственного медицинского университета. Положения, выносимые на защиту 1. Система поиска (основанная на консенсусе прогнозных оценок) in silico позволяет проводить ретроспективный и проспективный анализ гипогликемических структур в широких гомологичных рядах циклических гуанидинов; 2. На основании результатов математических исследований, полученных несколькими методами (система PASS, ИТ «Микрокосм», подструктурный анализ, частотный анализ физико-химических свойств) установлено, что циклические гуанидины по силе гипогликемической активности расположились в следующей последовательности:N9-ДгИмБИ=ПрмБИ>2-ИмиБИ>N1N9-ДгИмБИ>N9-ИмБИ >N1-ИмБИ>ТрзиБИ>ТрзоБИ>2-АмБИ; 3. Циклические гуанидины являются структурой, на основе которой можно проводить поиск веществ, проявляющих гипогликемическую активность; 4. Выявлены базовые структуры, производные которых проявляют гипогликемическое действие: N9-2,3-дигидро-имидазо[1,2-a]бензимидазола и 2,3,4,10-тетрагидропиримидо[1,2-a]бензимидазола и одна химическая структура у соединения-лидера РУ-254 с помощью компьютерных технологий; 5. Соединение диабенол в виде субстанции и твердой лекарственной формы оказывал плейотропное атидиабетагенное действие: стабилизировал содержание β-клеток, повышал содержание с-пептида, снижал гликемию, скорости гликолиза и гликогенолиза, увеличивал глюконеогенез при длительном курсовом введении. Степень достоверности и апробации результатов Достоверность экспериментальных данных обеспечивалась применением верифицированных методов исследований, экспериментальных моделей, лабораторных животных (крысах линии wistar и белых беспородных крысах (700), мышах (600) и кроликов-самцов породы «Шиншилла» (10) и методов исследования in silico. Анализ данных и их обобщение проведены с применением методов математической статистики и прикладной математики, соответствующих характеру полученных данных и задачам диссертационной работы. Все выявленные закономерности, эффекты, обобщения и выводы подтверждались сериями независимых экспериментов, компьютерных расчетов и результатами статистического анализа. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на XVIII российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 11-15 апреля 2011); IV всероссийском научно-практическом семинаре молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» (Волгоград, 29-31 октября 2012); IV съезде фармакологов России (Казань, 18-21 сентября 2012); XX российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 15-19 апреля 2013); первой российской конференции по медицинской химии «MedChem Russia-2013» с международным участием (Москва, 8-12 сентября 2013); XX - Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (Екатеринбург, 26-30 сентября 2016). Публикации. По теме диссертации опубликовано 35 печатных работ, в том числе 13 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ и 2 монографии. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 285 страницах машинописного текста, иллюстрирована 59 таблицами (а также 63 таблицами в приложениях), 38 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (глава I), экспериментальной части (главы II-VIII), обсуждения результатов, заключения, включающего выводы, практические рекомендации, списка литературы и приложений. Список литературы включает 146 отечественных и 199 иностранных источника. Личный вклад автора. Автору принадлежит существенная роль в формировании научной тематики, обосновании цели и постановке задач. Автор принимал непосредственное участие в создании базы данных соединений, содержащих гуанидиновую группировку и испытанных на гипогликемические свойства; проведении большинства экспериментов in vivo и in vitro, а также исследований in silico. Интерпретация и анализ полученных результатов, их публикация в научных изданиях и обсуждение на конференциях, формулировка выводов и практических рекомендаций, а также написание диссертации выполнено автором лично.