ИСТИНА

Впервые для TvDAAO детально изучен механизм температурной инактивации при различных температурах и концентрациях фермента. Показано, что в диапазоне температур 50 60 оС реализуется диссоциативный механизм термоинактивации, при более высоких и низких температурах инактивация протекает в соответствии с мономолекулярным механизмом. В настоящей работе впервые были получены мутантные формы оксидазы D аминокислот из дрожжей T. variabilis с улучшенными свойствами. Введение точечных аминокислотных замен позволило увеличить каталитическую эффективность с рядом D аминокислот в 2 8 раз. Температурная стабильность одного из мутеинов была увеличена в 2,2 раза по сравнению с ферментом дикого типа (wt TvDAAO). Было показано, что введение различных аминокислотных замен в одно и то же положение приводит к получению мутантных форм фермента с различным профилем субстратной специфичности. Использование подхода по гидрофобизации белковой глобулы позволило получить кристаллы мутантного фермента. В результате впервые для оксидазы D аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis была определена трехмерная структура (разрешение 1,8 Å). Разработана высокоэффективная система экспрессии рекомбинантной TvDAAO в клетках E.coli с выходом 35000 Ед с литра среды, что превышает известные мировые аналоги минимум в 2 раза. Получены две мутантные формы фермента, каталитическая эффективность которых в реакции окисления цефалоспорина С в 3 и 4,4 раза выше по сравнению с ферментом дикого типа. Три мутантные TvDAAO не взаимодействуют с D-аланином, что делает их идеальными кандидатами для использования в электрохимических биосенсорах для селективного определения D-серина в нервных тканях. Разработана методика количественного определения DAAO как в биологических жидкостях, так и в колониях целых клеток, что было использовано для скрининга библиотек мутантных клонов. Определение трехмерной структуры фермента позволило создать основу для проведения экспериментов по его белковой инженерии.