ИСТИНА

1. Проведено клонирование гена формиатдегидрогеназы из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101 в составе фазмидного вектора k pSL5 в Escherichia coli. Показано, что ген формиатдегидрогеназы располагается в EcoRI фрагменте хромосомной ДНК размером 15 т.п.н. Показано, что ген располагается в HindIII - BglII фрагменте ДНК, размером 2,3 т.п.н., и транскрибируется в направлении HindIII --> BglII. 2. Определена первичная структура гена формиатдегидрогеназы и прилегающих к нему областей. Показано наличие открытой рамки считывания, размером 1200 нуклеотидов, кодирующей полипептид длинной 400 аминокислот, почти полностью совпадающий с аминокислотной последовательностью формиатдегидрогеназы, полученной ранее при пептидном секвенировании. Сравнение структурных частей генов формиатдегидрогеназ из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101 и метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha показало наличие 59,7% гомологии. В 5'- области, размером 460 нуклеотидов, примыкающей к гену формиатдегидрогеназы, не обнаружено последовательностей, характерных для промотороподобных структур Escherichia coli. 3. Показано, что критической стадией для синтеза формиатдегидрогеназы в Escherichia coli является стадия транскрипции. Получены 3 различные конструкции, обеспечивающие эффективный синтез (до 7% растворимого клеточного белка) активной NAD-зависимой формиатдегидрогеназы в Escherichia coli. 4. Проведено сравнение свойств нативной и рекомбинантной формиатдегидрогеназ. Показано, что по физико-химическим и кинетическим характеристикам синтезируемая в Escherichia coli формиатдегидрогеназа соответствует наиболее щелочной изоформе формиатдегидрогеназы, выделенной из Pseudomonas sp.101. Предложена модель, объясняющая существование нескольких изоформ NAD-зависимой формиатдегидрогеназы из Pseudomonas sp.101.