ИСТИНА

Ранее коллективом под руководством И.Г. Газарян (Smirnova et al, Chem&Biol, 2010) были найдены два эффективных активатора HIF, которые были обозначены как Соединение 7 и Соединение 8. Эти соединения обеспечивали стабилизацию HIF в суб-микромолярных концентрациях, однако работа была выполнена на целых клетках. На чистых препаратах PHD ингибирующее действие вышеуказанных соединений проверено не было. Цели и задачи исследования. В диссертационной работе были поставлены следующие задачи: 1) Клонирование каталитического домена пролилгидроксилазы человека в клетках E.coli и разработка метода получения рекомбинантного фермента. Сравнение свойств растворимого фермента и препарата, полученного реактивацией из телец включения. 2) Подтверждение специфического ингибирования фермента молекулами-кандидатами, идентифицированными ранее как активаторы HIF с помощью метода высокопроизводительного скрининга на клеточных линиях. 3) Апробация соединений 7 и 8 в микробиореакторе (МБР) «Гомункулус» на основе сфероидов дифференцированных клеток линии HepaRG для предсказания их гепатотоксичности. 4) Разработка и валидация панели специфических субстратов и ингибиторов четырех изоферментов Р450, наиболее вовлеченных в трансформацию ксенобиотиков у человека, для использования в МБР «Гомункулус». Научная новизна работы. Впервые методом рефолдинга из телец включения получена рекомбинантная HIF пролилгидроксилаза человека. Для оптимизации реактивации была разработана непрерывная методика регистрации активности фермента по окислению ферроцианида в присутствии белка HIF или его короткого пептида. Было показано, что фермент, полученный методом рефолдинга, отличается более высокой каталитической активностью, чем фермент из растворимой фракции. Показано, что молекулы-кандидаты в антигипоксанты являются истинными ингибиторами очищенного фермента. Проведена апробация и валидация панели субстрат-ингибитор в МБР на клеточной линии HepaRG для изучения метаболизма соединений 7 и 8. Практическая значимость работы. Оптимизирована панель субстрат-ингибитор серии цитохромов Р450 из печени человека и проведена ее валидация с использованием двух известных лекарственных препаратов – варфарина и дазатиниба - в микробиореакторе (МБР) «Гомункулус» на основе сфероидов дифференцированных клеток линии HepaRG. Далее панель субстрат-ингибитор была использована для доклинической оценки токсичности и путей биотрансформации молекул-кандидатов в антигипоксанты. Показано, что молекулы-кандидаты претерпевают гидроксилирование под действием цитохромов HepaRG и не являются гепатотоксичными в широком диапазоне концентраций. Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на XXI International Conference INPEC-2014 (International Network of Protein Engineering Centers) (Санкт-Петербург, Россия, 2014), International Conference "Biocatalysis 2015: Fundamentals and Applications" (Московская область, Россия, 2015) и European Congresses on Alternatives to Animal Testing (Linz, Austria, 24.08-27.08.2016). Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ: 3 статьи (все журналы входят в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК РФ) и 4 тезисов докладов конференций. Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения; обзора литературы; описания материалов и методов; результатов и их обсуждения; выводов и списка цитируемой литературы, включающего 137 ссылок. Работа изложена на 131 странице и включает в себя 48 рисунков, 11 схем уравнений реакций и 14 таблиц.