ИСТИНА

В результате систематического исследования влияния широкого круга азот-, серо- и фосфорсодержащих органических соединений на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы из пекарских дрожжей в реакции окисления этанола никотинамидадениндинуклеотидом установлено, что ингибиторами фермента являются азотсодержащие гетероциклические соединения (в том числе лекарственные препараты ноотропил и кетотифен), представляющие собой либо конденсированные системы из двух или трех ароматических шестичленных циклов, либо являющиеся производными пятичленных гетероциклических соединений – имидазола и 1,2,3-триазола; а также аминокислоты, содержащие атом азота в цикле. Наиболее эффективные ингибиторы  1,10-фенантролин, 8-гидроксихинолин, 1,2,3-бензотриа-зол, 2,2’-дипиридил, ЭДТА. Показано, что без удаления избытка органических лигандов  ингибиторов алкогольдегидрогеназы (1,10-фенантролина, ЭДТА, 1,2,3-бензотриазола), получается не истинный апофермент, а фермент, ингибированный не более, чем на 40%, то есть “псевдоапофермент”. Предложена методика получения истинного апофермента алкогольдегидрогеназы с использованием в качестве органических лигандов 1,10-фенантролина или ЭДТА и диализа для удаления их избыточного количества. Установлено, что из большого числа изученных ионов металлов, имеющих либо близкий к цинку ионный радиус, либо сродство к сульфгидрильным группам белка, ингибирующее действие на каталитическую активность нативной алкогольдегидрогеназы оказывают цинк(II), кадмий(II), медь(II), ртуть(II), серебро(I), свинец(II); псевдоапофермент АДГ реактивируют  цинк(II), кобальт(II), никель(II), кадмий(II), медь(II), железо(III), а истинную апо-АДГ, полученную с использованием 1,10-фенантролина и ЭДТА, реактивирует только Zn(II). Разработана высокочувствительная , точная и селективная методика определения кофактора алкогольдегидрогеназы – цинка(II) по его реактивирующему действию на апофермент. В результате оптимизации условий проведения сопряженных ферментативной и неферментативной индикаторной реакций на разных носителях  МКЦ, силикагелях, ППУ, и изучения на них каталитической активности фермента, получены высокочувствительные и стабильные препараты алкогольдегидрогеназы, иммобилизованной физически на силикагеле и ковалентно  в альбумине. Разработана визуальная тест-методика определения цинка(II) по реактивации апо-АДГ, физически иммобилизованной на силикагеле. Разработанные методики определения наиболее эффективных ингибиторов нативной алкогольдегидрогеназы: ряда азотсодержащих гетероциклических соединений, в том числе лекарственных препаратов, аминокислот, пестицида параоксона, цинка(II), ртути(II), серебра(II), меди(II), метилртути (СН = 1 нМ – 0.1 мМ, sr = 0.01 – 0.12), а также тест-методики определения метилртути по ее ингибирующему действию на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы, иммобилизованной физически на силикагеле и ковалентно - в альбумине (СН 1 нМ и 10 нМ, sr=0.04) обосновывают целесообразность использования этого фермента в химическом анализе.