ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Обнаружено новое состояние белковых молекул, промежуточное по своим свойствам между нативным и полностью развернутым состояниями белка, получившее название состояния расплавленной глобулы. Это состояние характерно для многих белков при умеренных концентрациях денатурантов, изменении рН среды, нагреве и других дестабилизирующих воздействиях. В результате его детального изучения с помощью многих физических методов, несущих информацию о различных уровнях организации белковых структур, показано, что состояние расплавленной глобулы обладает следующими основными свойствами. а) Компактность, близкая к компактности нативных белков. б) Значительное содержание регулярной вторичной структуры, сравнимое с регулярной вторичной структурой нативного белка. в) Отсутствие кооперативного температурного плавления при микрокалориметрических исследованиях: зависимость парциальной удельной теплоемкости от температуры имеет вид гладкой кривой без пика плавления, характерного для нативных белков. г) Значительные локальные флуктуации белковой структуры, прежде всего боковых групп, приводящие к симметризации их окружения и отсутствию выраженного спектра КД в ближней ультрафиолетовой области, быстрому дейтерообмену, характерным спектрам ЯМР, близким к спектрам развернутых белков. На основании полученныых данных предложена модель состояния расплавленной глобулы, согласно которой это состояние соответствует уменьшению ван-дер-ваальсовых и других специфических взаимодействий, определяющих уникальную третичную структуру белка и размораживанию мелкомасштабных флуктуаций структуры, в то время как водородные связи главной цепи и гидрофобные взаимодействия в молекуле белка в значительной степени сохранены. Показано, что состояние расплавленной глобулы накапливается в процессе ренатурации белков, то есть является кинетическим промежуточным состоянием на пути сворачивания белка in vitro. Сделано предположение об участии состояния расплавленной глобулы в процессе самоорганизации белка in vivo а также других процессах, связанных со структурой и функцией белков. В настоящее время это предположение получило подтверждение во многих исследованиях, посвященных роли состояния расплавленной глобулы в процессах взаимодействия вновь синтезированных белков с шаперонами, транспорта белков через клеточную мембрану, связывания с лигандами, в получении мутантных и искусственных белков и т.д. С помощью методов генной инженерии получен искусственный белок альбебетин, сконструированный под заданную пространственную структуру, образованную двумя альфа-спиралями лежащими на антипараллельном бета-листе, которая не наблюдалась до сих пор в природных белках. Для его первичного исследования применена новая методика быстрого тестирования структуры мутантных и искусственных белков, позволяющая оценивать их общие структурные свойства, используя минимальные количества радиоактивно меченного образца, полученного в бесклеточной системе трансляции, без его предварительной очистки. Получена эффективная система экспрессии искусственных белков в E.coli в виде слитных белков с мальтозо-связывающим белком с их последующим расщеплением высокоспецифичной протеазой фактор Xа. Эта система экспресси позволила наработать альбебетин и его биологически активный вариант в препаративных количествах с использованием аффинной хроматографии на амилозной смоле. Поведено детальное исследование структуры искусственного белка альбебетина с помощью ряда физико-химических методов и установлено, что альбебетин находится в состоянии, соответствующем состоянию расплавленной глобулы. Показано, что он обладает близкой к заданной вторичной структурой и компактной и относительно стабильной пространственной структурой, не противоречащей заданной. На базе альбебетина получен первый искусственный белок, обладающий заданной функцией: биологически активный фрагмент 131-138 интерферона альфа-2 человека, активирующий бласт-трансформацию тимоцитов мыши, включен в состав искусственного белка. Проведено исследование общих структурных характеристик и биологических свойств альбебетина с фрагментом интерферона и показано, что он сохраняет компактность и относительную стабильность альбебетина, обладает высокой аффинностью к рецепторам на поверхности тимоцитов мыши и активирует реакцию бласт-трансформации тимоцитов при концентрациях порядка 0,01 нМ. Таким образом, показана возможность использования искусственнных белков в качестве носителей отдельных биологических функций природных белков, что позволяет выделять исследуемые функции "в чистом виде", отделяя их от других активностей исходных природных белков для детального изучения, получения модельных белковых конструкций, не обладающих побочными активностями, и других целей.