ИСТИНА

Цель работы. Основной задачей настоящего исследования являлась разработка научных основ создания новых типов флуоресцентных меток, пригодных для использования в различных методах иммуноана- лиза и других анализов по связыванию. Наиболее широко используемые метки (производные ксантеновых красителей) имеют очень малое стоксово смещение флуоресценции (что приводит к сильному влиянию светорассеяния на фоновые сигналы), и неудачно расположенные длины волн возбуждения и флуоресценции, налагающиеся на собственное свечение сыворотки крови и других физиологических жидкостей. Поэтому, основное внимание было уделено разработке общих подходов к минимизации фоновых сигналов и повышению удельного сигнала метки в условиях реальных биохимических анализов. Былапоставлена цель поиска и изучения наиболее эффективных фотолюми- несцентных меток, которые могут использоваться как в методах стационарной флуоресценции, так и с временным разрешением. Значительное внимание в работе было уделено изучению физико- химических свойств меток в условиях проведения иммунологического анализа с целью максимального повышения чувствительности и надежности измерения. С учетом особенностей новых меток разраба- тывались также новые методы проведения иммуноанализа. Научная новизна. Предложен метод флуоресцентного иммуноана- лиза с разрешением по длинам волн. Наиболее перспективные метки такого типа - порфирины,- позволяют на обычных флуориметрах получать чувствительность, сравнимую с традиционным иммуноперок- сидазным методом, но при этом упрощается проведение анализа. Изучены свойства ряда водорастворимых порфиринов в мицеллярных растворах. Разработаны методы получения ковалентных конъюгатов с белками. Показана применимость разработанного метода для анализа любых типов антигенов в любых вариантах иммунологического анализа. В методе флуоресцентного иммуноанализа с временным разреше- нием с использованием лантанидов предложены новые комплексоны на основе ДТПА и разработаны общие подходы к минимизации влияния процессов перекомплексообразования ионов лантанидов в ходе имму- нологической реакции. Разработаны оригинальные методики для мето- да DELFIA, в которых европий вводится в меченное соединения на одной из стадий анализа, что позволяет повысить чувствительность и надежность метода. Предложена серия комплексонов сложной структуры на основе производных ДТПА и аминодикетонов, позволяющая проводить анализ без использования специальных усиливающих растворов в одну ста- дию. Предложенные комплексоны по чувствительности более чем на порядок превосходят наилучшие из описанных в литературе и могут быть использованы в любом варианте анализа (конкурентном или сэндвич). Разработан метод фосфоресцентного иммуноанализа с использо- ванием металлопорфиринов. Изучение высокотемпературной фосфорес- ценции металлопорфиринов в мицеллярных растворах позволило подоб- рать условия, в которых по абсолютной чувствительности Pd-копро- порфирин превосходит все описанные в литературе метки для метода ФИАВР (TR-FIA). Разработаны методы получения конъюгатов и прове- дения иммуноанализа. Использование металлопорфиринов с щимися спектральными характеристиками позволило разработать метод одновременного определения нескольких антигенов. Использование явления замедленной флуоресценции позволило повысить чувствитель- ность определения ряда бактериальных антигенов, обладающих собственной высокотемпературной фосфоресценцией. Использование Pd-копропорфирина в качестве метки в иммуно- анализе открывает новые возможности для разработки методов анали- за, построенных на комплиментарных взаимодействиях. Получены моноклональные антитела к Pd-копропорфирину, изучена их специфичность по отношению к различным порфиринам. Разработан метод фосфоресцентного иммуноанализа инсулина с использованием моноклональных антител к Pd-копропорфирину, исключающий стадию получения ковалентных конъюгатов: весь анализ построен на комплементарных взаимодействиях антитело - антиген. Научная и практическая ценность. Предложенные типы меток создают основу нового направления высокочувствительной флуорес- центной диагногстики. Полученные результаты могут быть использо- ваны для создания нового поколения медицинских диагностикумов, биосенсоров для контроля биотехнологических производств и охраны окружающей среды, при проведении научных исследований. Изучение физико-химических свойств порфиринов и металлопор- фиринов в мицеллярных растворах позволило разработать специальные растворы для определения сверхмалых количеств этих соединений. Полученные к Pd-копропорфирину моноклональные антитела могут использоваться при проведении исследовательских работ, например при скрининге гибридом.В перспективе на основе этих моноклональ- ных антител могут быть получены биспецифические моноклональные антитела пригодные для клинической диагностики. Полученная к Pd-копропорфирину панель моноклональных антител (18 клонов) позволила выявить ряд общих с гемовыми белками зако- номерностей в формировании центра связывания металлопорфирина. Совместно с рядом медицинских учреждений разработаны флуо- ресцентные методы анализа тироксина, дигитоксина, инсулина, раково-эмбрионального антигена, вирусов гриппа, ящура пригодные для широкого использования.