ИСТИНА

Первоначально амилоидные фибриллы были обнаружены во внеклеточных депозитах при ряде тяжелых заболеваний, связанных с нарушением фолдинга белков, таких как болезни Альцгеймера и Паркинсона, диабет второго рода, прионные заболевания, и т.д. Исследования последних лет показали, что при определенных условиях и другие белки, никак не связанные с возникновением болезней (а, возможно, все белки), могут образовывать амилоидо-подобные фибриллы. Поскольку фибриллярное состояние, обогащенное бета-складчатыми структурами, по-видимому, является одним из основных состояний белковой молекулы, исследование амилоидных фибрилл актуально для решения фундаментальной проблемы фолдинга белков. Для диагностики возникновения амилоидных фибрилл широко и эффективно используется флуоресцентный краситель тиофлавин Т (ThT). Однако к моменту начала нашей работы не существовало однозначного представления о характеристиках и спектральных свойствах свободного и связанного с амилодными фибриллами красителя, а также о механизме взаимодействия ThT с амилоидными фибриллами. Кроме того, поскольку в настоящее время стало очевидным, что ThT можно использовать для изучения структуры амилоидных фибрилл возникла необходимость определения параметров связывания красителя с амилоидными фибриллами. В связи с этим целью данной работы стало исследование особенностей взаимодействия флуоресцентного зонда ThT с амилоидными фибриллами, полученными на основе различных белков. Результаты исследования позволили по-новому взглянуть на спектральные свойства свободного и связанного с амилоидными фибриллами ThT. Было дано новое объяснение существованию «коротковолновых» полос флуоресценции и возбуждения флуоресценции ThT в водных растворах. Сделано заключение о том, что эти аномальные полосы обусловлены наличием в растворе молекул ThT с нарушенной системой π-сопряженых связей бензтиазольного и аминобензольного колец. Измерение интенсивности флуоресценции ThT в водно-глицериновых смесях позволило пересмотреть существующие представления о причинах возрастания квантового выхода флуоресценции красителя при его встраивании в амилоидные фибриллы. Показано, что значение квантового выхода флуоресценции красителя, встроенного в амилоидные фибриллы, обусловлено конформацией молекул связанного красителя в основном состоянии и подвижностью фрагментов молекулы ThT друг относительно друга в возбужденном состоянии. Полученные результаты позволили пересмотреть существующие представления о механизме связывания ThT с амилоидными фибриллами и сделать заключение о том, что краситель встраивается в фибриллы в мономерной форме, а предположения об образовании им димеров и мицелл необоснованны. Был разработан принципиально новый подход, который позволил определить число мод связывания, константы связывания и число мест связывания ThT с амилоидными фибриллами на основе различных амилоидогненных белков, а также спектры поглощения, коэффициенты молярной экстинкции и квантовый выход флуоресценции связанного красителя. Показано что, связывание ThT с амилоидными фибриллами на основе инсулина, лизоцима и Абета-пептида характеризуется различными значениями параметров связывания и характеристик встроенного красителя. На основании полученных данных сделан вывод о том, что фибриллы, полученные на основе разных белков, различны, и предлагаемый нами подход может использоваться для сравнения и изучения их структуры. Разработанный подход является универсальным и может быть использован для определения константы связывания с амилоидными фибриллами флуоресцентных красителей, способных преодолевать гематоэнцефалический барьер, а также для анализа взаимодействия амилоидных фибрилл с химическими веществами (в том числе нефлуоресцирующими), которые способны подавлять процесс образования амилоидных фибрилл.