ИСТИНА

Диссертационная работа Головиной А.Я. посвящена исследованию субстратной специфичности гипотетических РНК-метилтрансфераз YibK, YafE и YfiC E. coli, а также разработке метода выделения 30S субчастицы рибосомы E. coli, содержащих мутантную 16S рРНК. Транспортные и рибосомные РНК крайне подвержены различным посттранскрипционным модификациям, однако функции многих модифицированных нуклеотидов бактериальных РНК до сих пор остаются неясными. Как правило, это связано с отсутствием данных о ферментах, осуществляющих их. Знание о генах, кодирующих тот или иной фермент, дает возможность собрать исчерпывающую информацию о его функции. Исследование функциональных свойств гипотетических метилтрансфераз представляет большой научный интерес и является актуальным на сегодняшний день. Для изучения влияния модифицированных нуклеотидов РНК на функционирование рибосомы часто применяют мутагенез модифицируемых остатков. Полученные мутации часто летальны для клетки, и гены мутантных рРНК можно экспрессировать только одновременно с генами рРНК дикого типа. В связи с этим, для дальнейшего изучения свойств рибосом, несущих летальные мутации в рРНК, существует необходимость создать способ выделения рибосом, несущих в себе соответствующую летальную мутацию из смеси с рибосомами дикого типа. Объектом исследования в работе Головиной А.Я. стали функции трех гипотетических метилтрансфераз E. coli: YibK, YafE и YfiC, а также разработка метода аффинного выделения 30S субчастиц рибосомы E. coli. Основные результаты, полученные соискателем, заключаются в следующем: 1) Метилтрансферазы YafE и YibK E. coli способны метилировать in vitro 30S субчастицы рибосомы как из нокаутного штамма, так и из дикого типа. Модификация нуклеотида m2G1516 16S РНК, соотвествующий фермент для которой до сих пор не найден, не осуществляется белками YafE и YibK. 2) Белок YfiC является SAM-зависимой метилтрансферазой и отвечает за модификацию нуклеотида А37 тРНК1Val E. coli с образованием остатка m6A. 3) Метилирование тРНК1Val с образованием m6А37 способствует выживанию клеток при осмотическом и окислительном стрессе. 4) Вставка стрептавидин-связывающего аптамера в спираль 33а 16S рРНК позволяет выделять функционально-активные 30S субчастицы в чистом виде с помощью аффинной хроматографии. Научная и практическая значимость. В работе Головиной А.Я. впервые была показана субстратная специфичность белков YibK, YafE и YfiC E. coli, а также разработан метод эффективного выделения 30S субчастиц рибосомы, несущих различные, в том числе и летальные, мутации. Известно, что большинство антибиотиков воздействует на рибосому, и механизм устойчивости к ним зачастую связан со способностью бактериальных ферментов метилировать некоторые нуклеотиды рРНК. Создание методологии поиска ферментов, отвечающих за данные модификации, может иметь важное практическое значение для разработки новых антибиотиков. Также важным является создание простого и эффективного метода аффинного выделения рибосомных субчастиц. Он облегчит исследование свойств рибосом, несущих любую летальную мутацию. В ходе работы была идентифицирована ферментативная активность белка YfiC Escherichia coli и исследована функциональная значимость соответствующей ей модификации, найдены субстраты для метилтрансфераз YibK и YafE, а также предложен эффективный метод выделения мутантных 30S субчастиц рибосомы, что представляет значительный вклад в биоорганическую химию.