ИСТИНА

Диссертационная работа посвящена исследованию взаимодействия малого белка теплового шока HspB6 с универсальным адаптерным белком 14-3-3. Основной функцией малых белков теплового шока является поддержание частично денатурированных белков в растворимом состоянии и предотвращение их агрегации, однако они участвуют во многих других процессах, например, в регуляции апоптоза и динамики цитоскелета. Так, малый белок теплового шока HspB6 принимает участие в регуляции расслабления гладкой мускулатуры, не зависящего от фосфорилирования легких цепей миозина и концентрации Ca2+ в цитоплазме. Для эффективного выполнения этой функции, по-видимому, необходимо прочное взаимодействие между фосфорилированным HspB6 и универсальным белком-адаптером 14-3-3. Взаимодействие белка 14-3-3 со многими белками-партнерами подробно исследовано, однако взаимодействие 14-3-3 с малыми белками теплового шока практически не анализировалось. Несмотря на то, что участие малого белка теплового шока HspB6 в процессе расслабления гладкой мускулатуры является общепринятым фактом, механизм действия HspB6 и способы регуляции этого процесса остаются неизвестными. В последнее время было предложено использовать фосфорилированный HspB6 (или его фосфорилированные пептиды) в качестве фармакологического агента, предотвращающего сокращение гладких мышц сосудов и воздухоносных путей. В связи с этим исследование взаимодействия HspB6 и 14-3-3 может быть важным и актуальным как с теоретической, так и с практической точки зрения. На первом этапе работы было детально проанализировано взаимодействие HspB6 и 14-3-3 и установлено, что только фосфорилированный HspB6 способен образовывать прочные комплексы с 14-3-3. В этой же части работы было изучено влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование 14-3-3, на его способность связывать HspB6. На основе выполненных исследований был сделан вывод о том, что фосфорилирование 14-3-3 оказывает непосредственное влияние на прочность комплексов, образуемых этим белком с HspB6, а взаимодействие между двумя белками может регулироваться не только путем фосфорилирования HspB6, но также путем фосфорилирования 14-3-3. На следующем этапе работы было проанализировано взаимодействие HspB6 с мономерными мутантами 14-3-3, по-видимому, присутствующими в клетке в небольшом количестве. Оказалось, что эти мутанты способны специфически и с высоким сродством взаимодействовать с фосфорилированным HspB6. Учитывая тот факт, что мономерные формы 14-3-3 изучены не достаточно подробно, эти исследования представляются интересными и важными для более полного понимания способов регуляции активности белков семейства 14-3-3. Ключевым моментом в работе была проверка гипотезы о том, что расслабление гладких мышц, вызываемое HspB6, обусловлено способностью этого белка вытеснять фосфорилированный кофилин из его комплекса с 14-3-3. После освобождения из комплекса с 14-3-3 кофилин подвергается дефосфорилированию, активируется и способствует деполимеризации актиновых филаментов, что в конечном итоге приводит к расслаблению. Используя различные биохимические методы, было показано, что кофилин не способен образовывать комплексы с 14-3-3. Это позволило опровергнуть одну из доминирующих гипотез о механизме регуляции сократительной активности гладких мышц. Взамен отвергнутой была предложена альтернативная гипотеза, согласно которой появление в клетке фосфорилированного HspB6 может привести к вытеснению из комплекса с 14-3-3 регуляторных ферментов, участвующих в фосфорилировании/дефосфорилировании кофилина, и их активации, что будет влиять на степень фосфорилирования кофилина и приведет к перестройке актинового цитоскелета и расслаблению гладкой мускулатуры.