ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Основной целью данного исследования является оценка реальных значений митохондриального мембранного потенциала с одновременным рассмотрением механизма удержания родаминовых красителей в митохондриях опухолевых клеток. Эти две задачи взаимосвязаны, и их решение носит не только методическое, но и диагностическое значение, позволяя по удержанию красителей судить о возможной онкологической трансформации клетки. Главная задача настоящего проекта – проверка гипотезы, что удержание родаминовых красителей в митохондриях опухолей обеспечивается не за счет повышенного митохондриального потенциала, а за счет других процессов. Предполагается, что такими процессами могут быть либо связывание красителя со специфическими компонентами митохондрий и/или превращение положительно заряженной молекулы красителя, представляющей из себя сложный эфир, в незаряженную молекулу (цвиттер-ион), проницаемость мембран для которой существенно ниже, чем для положительно заряженной структуры. Предполагается, что такое превращение обеспечивается внутриклеточными и внутримитохондриальными эстеразами. Решение поставленных задач будет сводиться к выявлению возможного взаимодействия флуоресцентных митохондриальных красителей с потенциальными мишенями (белки, липиды, нуклеиновые кислоты) разных компартментов митохондрий (внешние или внутренние мембраны, межмембранное пространство и матрикс) и идентификации возможных продуктов деградации митохондриальных зондов. В плане развития фундаментальной науки полученные результаты могут дать рекомендации по исключению артефактов в определении митохондриального мембранного потенциала в живой клетке с целью представления его реальных значений, а в плане развития клинической науки могут быть представлены рекомендации по созданию более эффективных противоопухолевых лекарств с пролонгированным действием.
The main goal of this study is estimation of the real values of the mitochondrial membrane potential with simultaneous consideration of the mechanism of retention of rhodamine dyes in the mitochondria of tumor cells. These two tasks are interrelated, and their solution has not only methodological, but also diagnostic value, allowing by the retention of dyes to judge on the possible oncologic transformation of cells. Main task of this project is to test the hypothesis that the retention of rhodamine dyes in mitochondria of tumors is not caused by the increased mitochondrial potential, but is due to alternative processes. It is proposed that these processes can either be the binding of the dye with the specific components of the mitochondria and/or the conversion of the positively charged molecule of the dye, which is the ester into uncharged (zwitter-ion) species, which membrane permeability is significantly lower than of the positively charged structure. It is suggested that such a transformation is provided by the intracellular and intra-mitochondrial esterases. The solution may include identification of interaction of fluorescent mitochondrial dyes with potential targets (proteins, lipids, nucleic acids) from different mitochondrial compartments (outer or inner membranes, intermembrane space and matrix) and identification of possible degradation products of mitochondrial probes. In terms of development of fundamental science, the results can give guidelines how to avoid artifacts in determination of mitochondrial membrane potential in live cells in order to provide its true values and as to the development of clinical science they can provide recommendations on the introduction of more effective anticancer drugs with prolonged action.
Ожидается получение ответа на вопрос о причине избыточного накопления родаминовых красителей в митохондриях опухолевых клеток. Будет оценена возможность специфического связывания этих красителей с разными компонентами митохондрий. Будет дан положительный или отрицательный ответ на высказанное предположение о том, что по крайней мере часть механизма, обеспечивающего удержание родаминовых красителей в опухолевых клетках, обеспечивается за счет активной работы внутриклеточных и внутримитохондриальных эстераз. В результате работы будут получены данные по функциональным различиям между опухолевыми и нормальными клетками, что является чрезвычайно важным для фундаментальной и практической онкологии. На практике будет проведена предложенная схема адекватной оценки величин мембранного потенциала митохондрий в клетках за счет исключения влияния выброса из клеток положительно заряженных красителей помпами неспецифической лекарственной устойчивости, влияния градиента рН на накопление зонда в митохондриях, а также влияния эндоэргонических реакций и условий, исключающих самогашение флуоресценции в митохондриях. Оценка вклада всех возможных компонентов приведет к получению реальных значений мембранного потенциала в митохондриях, что очень важно для фундаментальной и практической биоэнергетики.
У коллектива участников имеется весь необходимый методический арсенал для выполнения проекта. Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского МГУ оснащен лазерным конфокальным и флуоресцентным микроскопами, масс спектрометром, проточным цитофлуориметром, полярографом, установками для электрофореза и детекции флуоресценции в гелях. Коллектив участников проекта принадлежит к классической биоэнергетической школе и имеет длительный опыт работы с митохондриальными системами. Из предварительных экспериментальных и в настоящее время еще неопубликованных результатов надо отметить факт избирательного мечения компонентов митохондриального АТР-синтазного комплекса флуоресцентными производными семейства проникающих катионов, не несущих антиоксидативных функций, но обладающих свойствами мягких разобщителей. В других предварительных экспериментах показана сильная гетерогенность мембранного потенциала, выявленного при помощи зонда TMRE методом проточной цитофлуориметрии культуры глиомы и при разных патологических воздействиях на нормальные клетки.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 31 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Проблемы использования родаминовых красителей для оценки митохондриального мембранного потенциала в нормальных и опухолевых клетках. |
Результаты этапа: Было обнаружено, что при инкубации потенциал-зависимых флуоресцентных зондов – Р123 (зеленая флуоресценция, интенсивность которой зависит от митохондриального потенциала) и JC1 (последний дает зеленую флуоресценцию в низкопотенциальных митохондриях и красную флуоресценцию в высокопотенциальных митохондриях) с клетками глиомы последние начинают флуоресцировать, однако интенсивность флуоресценции в клетках очень разнится. Это означает высокую гетерогенность популяции этих опухолевых клеток.Эта гетерогенность может быть вызвана тем, что мембранный потенциал в разных клетках априори может иметь разные величины. Однако нет прямых докзательств того, что в тех клетках, в которых флуоресценция ниже, мембранный потенциал митохондрий ниже, так как он может быть настолько высоким, что в результате повышенного накопления флуоресцентного зонда в митохондриях будет происходить концентрационное гашение флуоресценции. В будущем это может быть проверено путем серьезного снижения концентрации родамина во внеклеточной среде. Другим фактором, регулирующим нахождение флуоресцентного зонда в митохондриях, является активность неспецифических помп в клеточной мембране, откачивающих лекарства (включая и зонды на митохондриальный потенциал) из клетки. Но какова бы ни была природа гетерогенности флуоресценции в раковых клетках глиомы, данная находка имеет важное фундаментальное значение. Это прежде всего объясняет необъяснимое не очень эффективное значение противоопухолевой терапии, так как совершенно четко заметно, что при наличии такой гетерогенности будут убиваться далеко не все клетки. С другой стороны, это подтверждает наши догадки о неоднозначности интерпретации данных флуоресценции митохондриальных зондов как индикаторов митохондриального мембранного потенциала. Поэтому теоретически задача в конечном счете может сводиться к первичному уменьшению гетерогенности (нормализации) митохондрий (для этого необходимо понять природу гетерогенности) и минимальному вкладу неспецифических помп множественной лекарственной устойчивости, предваряющих химиотерапию. Вклад неспецифических помп, ответственных за выброс из клеток, в значения внутриклеточной флуоресценции потенциал-зависимых флуоресцентных зондов занял в нашей работе значительное время. Изучение механизмов, с помощью которых опухолевые клетки в целом и их митохондрии в частности удерживают или выбрасывают ксенобиотические соединения остаются актуальной проблемой и является основой для разработки методов диагностики и лечения злокачественных опухолей. Поэтому часть нашего исследования была направлена на оценку митохондриального мембранного потенциала клеток глиомы С6 с использованием различных флуоресцентных зондов и сравнение их накопления с накоплением в нормальных астроцитах. Мы исследовали клетки глиомы С6 и астроциты крыс, которые были нагружены флуоресцентными митохондриальными зондами: TMRE, JC-1, Mitotrackers Red и Mitotracker Green. Флуоресценцию регистрировали с помощью лазерного конфокального микроскопа LSM700. Независимый от потенциала краситель Mitotracker Green позволил выявить в клетках классическую митохондриальную сеть без признаков фрагментации как в клетках глиомы, так и в астроцитах. Нагрузка потенциально зависимыми красителями (TMRE, JC-1 и Mitotracker Red) подтвердила возможность высокой гетерогенности митохондриального мембранного потенциала в клетках глиомы С6, если считать, что значения флуоресценции зондов полностью совпадают со значениями митохондриального мембранного потенциала. Как было рассмотрено выше, наиболее показательные результаты были получены с использованием зонда JC-1: культура содержала клетки глиомы с низкоэнергетическими митохондриями (зеленая флуоресценция), а также клетки с митохондриями с высоким потенциалом (красная флукоресценция). Однако и в пределах одной клетки наблюдались митохондрии разной функциональной активности. Видимо именно этой факт свидетельствует о том, что существует реальная гетерогенность мембранного потенциала, так как вклад неспецифических помп множественной лекарственной устойчивости должен был быть одинаков для всех митохондрий в пределах одной клетки, в которой в разных митохондриях мы наблюдали разную интенсивность флуоресценции. Кроме этого, коэффициент вариации интенсивности флуоресценции JC-1 был более чем в 2 раза выше в клетках глиомы по сравнению с астроцитами. Изучение изменений митохондриального потенциала в присутствии разобщителя CCCP в концентрациях 0,2, 1 и 5 мкМ дало неоднозначно интерпретируемые результаты, которые требуют дальнейшей разработки, что запланировано на следующий год работ. | ||
2 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Проблемы использования родаминовых красителей для оценки митохондриального мембранного потенциала в нормальных и опухолевых клетках. |
Результаты этапа: В 2019 году была продолжена работа по выявлению возможных внутриклеточных модификаций родамина 123 (Р123), являющегося исторически самым первым и простым зондом на мембранный потенциал митохондрий. Важность работы следовала из необходимости получения адекватных и правильных значений мембранного потенциала, который важен не только для клеточной энергетики, но и для выполнения множества клеточных функций, ибо при осуществлении ряда модификаций родамина выполнение этой методической задачи будет неоднозначной и трудно интерпретируемой. В качестве объектов, отвечающих за модификацию, были выбраны родственные неопухолевые (астроциты) и опухолевые (глиома) клетки, которые инкубировались в течение разного времени с Р123 или родаминовым производным митохондриально-направленных антиоксидантов (SkQR1) с последующим экстрагированием непосредственно из клеток или выделенных из них митохондрий. В бутанольных экстрактах проводили хроматографический и масс-спектральный анализ продуктов превращения. Основной трудностью работы оказалась сама методика подготовки образцов, высокая гетерогенность клеточных культур, требующая очень большого числа повторов для получения достоверного результата, и отсутствие специфичных ингибиторов цитохром Р450-индуцируемой модификации зондов и выброса продуктов модификации Р123 из клетки. Было подтверждено наше предположение о деэстерификации Р123 с образованием Р110. При этом деэстерифицирующая активность была существенно выше в митохондриях астроцитов. Было выявлено, что преимущественно в митохондриях происходит модификация Р123 по эстеразному пути, что означает превалирование митохондриальных форм эстераз над цитозольными. Сравнение митохондрий, выделенных из обработанных Р123 клеток глиомы, и митохондрий, полученных из интактных клеток глиомы после их инкубации с Р123, указывает на то, что в митохондриях, выделенных по обоим протоколам, в дополнение к эстеразным модификациям обнаруживаются и другие типы модификации структуры родамина 123. При инкубации клеток глиомы с Р123 в присутствии ингибитора Р450, амиодарона, такая модификация структуры не наблюдалась. Модификация Р123 происходила во времени с уже накопленным в митохондриях Р123, и измененные структуры могли в разной степени выбрасываться из клетки через неспецифические попмпы. Масс-спектрометрический анализ в сочетании с жидкостной хроматографией высокого разрешения показал, что результатом модификации молекулы P123 является появление во времени двух мажорных флуоресцирующих компонентов с массой 214 и 579. Теоретически вторая компонента не может быть объяснена глюкуронированием Р123. Структуру низкомолекулярной компоненты надлежит выяснить. При нагрузке клеток митохондриально-направленным флуоресцентным катионом SkQR1 с последующим хроматографическим анализом было обнаружено несколько компонентов. При инкубации SkQR1 с клетками глиомы с последующей экстракцией третичным бутанолом менялись физико-химические параметры этих компонентов с появлением низкомолекулярных фрагментов, что говорило о серьезной модификации молекулы SKQR1. При ингибировании трансформации молекулы флуоресцентного зонда амиодароном было обнаружено исчезновение указанных низкомолекулярных компонентов. После инкубации клеток с SkQR1 и верапамилом, ингибитором неспецифических помп откачки из клетки, обнаружилось не только появление дополнительной фракции на хроматограмме, но и изменение степени модификации SKQR1 в направлении увеличения числа минорных модифицированных продуктов. Используя флуоресцентную микроскопию, мы показали, что в результате воздействия разобщителя флуоресценция Р123 в астроцитах резко уменьшается, в то время как в клетках глиомы она сохраняется даже через 24 часа. Эти результаты подтвердились при использовании проточной цитофлуориметрии. Попытка найти изменения спектральных свойств Р123 после инкубации с клетками не увенчалась успехом, однако было обнаружение уширение полос эмиссии SkQR1 после длительной 24-ч экстракции из клеток глиомы, что не наблюдалось при работе с астроцитами. Таким образом, мы показали, что клетки глиомы и астроциты обладают разной способностью модификации флуоресцентных зондов Р123 и SkQR1, что является важным заключением для потенциального использования этих веществ как диагностических и терапевтических агентов. | ||
3 | 1 января 2020 г.-15 декабря 2020 г. | Проблемы использования родаминовых красителей для оценки митохондриального мембранного потенциала в нормальных и опухолевых клетках. |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".