Проблемы использования родаминовых красителей для оценки митохондриального мембранного потенциала в нормальных и опухолевых клетках.НИР

The problems of using rhodamine dyes for determination of the mitochondrial membrane potential in normal and tumor cells.

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 31 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Проблемы использования родаминовых красителей для оценки митохондриального мембранного потенциала в нормальных и опухолевых клетках.
Результаты этапа: Было обнаружено, что при инкубации потенциал-зависимых флуоресцентных зондов – Р123 (зеленая флуоресценция, интенсивность которой зависит от митохондриального потенциала) и JC1 (последний дает зеленую флуоресценцию в низкопотенциальных митохондриях и красную флуоресценцию в высокопотенциальных митохондриях) с клетками глиомы последние начинают флуоресцировать, однако интенсивность флуоресценции в клетках очень разнится. Это означает высокую гетерогенность популяции этих опухолевых клеток.Эта гетерогенность может быть вызвана тем, что мембранный потенциал в разных клетках априори может иметь разные величины. Однако нет прямых докзательств того, что в тех клетках, в которых флуоресценция ниже, мембранный потенциал митохондрий ниже, так как он может быть настолько высоким, что в результате повышенного накопления флуоресцентного зонда в митохондриях будет происходить концентрационное гашение флуоресценции. В будущем это может быть проверено путем серьезного снижения концентрации родамина во внеклеточной среде. Другим фактором, регулирующим нахождение флуоресцентного зонда в митохондриях, является активность неспецифических помп в клеточной мембране, откачивающих лекарства (включая и зонды на митохондриальный потенциал) из клетки. Но какова бы ни была природа гетерогенности флуоресценции в раковых клетках глиомы, данная находка имеет важное фундаментальное значение. Это прежде всего объясняет необъяснимое не очень эффективное значение противоопухолевой терапии, так как совершенно четко заметно, что при наличии такой гетерогенности будут убиваться далеко не все клетки. С другой стороны, это подтверждает наши догадки о неоднозначности интерпретации данных флуоресценции митохондриальных зондов как индикаторов митохондриального мембранного потенциала. Поэтому теоретически задача в конечном счете может сводиться к первичному уменьшению гетерогенности (нормализации) митохондрий (для этого необходимо понять природу гетерогенности) и минимальному вкладу неспецифических помп множественной лекарственной устойчивости, предваряющих химиотерапию. Вклад неспецифических помп, ответственных за выброс из клеток, в значения внутриклеточной флуоресценции потенциал-зависимых флуоресцентных зондов занял в нашей работе значительное время. Изучение механизмов, с помощью которых опухолевые клетки в целом и их митохондрии в частности удерживают или выбрасывают ксенобиотические соединения остаются актуальной проблемой и является основой для разработки методов диагностики и лечения злокачественных опухолей. Поэтому часть нашего исследования была направлена на оценку митохондриального мембранного потенциала клеток глиомы С6 с использованием различных флуоресцентных зондов и сравнение их накопления с накоплением в нормальных астроцитах. Мы исследовали клетки глиомы С6 и астроциты крыс, которые были нагружены флуоресцентными митохондриальными зондами: TMRE, JC-1, Mitotrackers Red и Mitotracker Green. Флуоресценцию регистрировали с помощью лазерного конфокального микроскопа LSM700. Независимый от потенциала краситель Mitotracker Green позволил выявить в клетках классическую митохондриальную сеть без признаков фрагментации как в клетках глиомы, так и в астроцитах. Нагрузка потенциально зависимыми красителями (TMRE, JC-1 и Mitotracker Red) подтвердила возможность высокой гетерогенности митохондриального мембранного потенциала в клетках глиомы С6, если считать, что значения флуоресценции зондов полностью совпадают со значениями митохондриального мембранного потенциала. Как было рассмотрено выше, наиболее показательные результаты были получены с использованием зонда JC-1: культура содержала клетки глиомы с низкоэнергетическими митохондриями (зеленая флуоресценция), а также клетки с митохондриями с высоким потенциалом (красная флукоресценция). Однако и в пределах одной клетки наблюдались митохондрии разной функциональной активности. Видимо именно этой факт свидетельствует о том, что существует реальная гетерогенность мембранного потенциала, так как вклад неспецифических помп множественной лекарственной устойчивости должен был быть одинаков для всех митохондрий в пределах одной клетки, в которой в разных митохондриях мы наблюдали разную интенсивность флуоресценции. Кроме этого, коэффициент вариации интенсивности флуоресценции JC-1 был более чем в 2 раза выше в клетках глиомы по сравнению с астроцитами. Изучение изменений митохондриального потенциала в присутствии разобщителя CCCP в концентрациях 0,2, 1 и 5 мкМ дало неоднозначно интерпретируемые результаты, которые требуют дальнейшей разработки, что запланировано на следующий год работ.
2 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Проблемы использования родаминовых красителей для оценки митохондриального мембранного потенциала в нормальных и опухолевых клетках.
Результаты этапа: В 2019 году была продолжена работа по выявлению возможных внутриклеточных модификаций родамина 123 (Р123), являющегося исторически самым первым и простым зондом на мембранный потенциал митохондрий. Важность работы следовала из необходимости получения адекватных и правильных значений мембранного потенциала, который важен не только для клеточной энергетики, но и для выполнения множества клеточных функций, ибо при осуществлении ряда модификаций родамина выполнение этой методической задачи будет неоднозначной и трудно интерпретируемой. В качестве объектов, отвечающих за модификацию, были выбраны родственные неопухолевые (астроциты) и опухолевые (глиома) клетки, которые инкубировались в течение разного времени с Р123 или родаминовым производным митохондриально-направленных антиоксидантов (SkQR1) с последующим экстрагированием непосредственно из клеток или выделенных из них митохондрий. В бутанольных экстрактах проводили хроматографический и масс-спектральный анализ продуктов превращения. Основной трудностью работы оказалась сама методика подготовки образцов, высокая гетерогенность клеточных культур, требующая очень большого числа повторов для получения достоверного результата, и отсутствие специфичных ингибиторов цитохром Р450-индуцируемой модификации зондов и выброса продуктов модификации Р123 из клетки. Было подтверждено наше предположение о деэстерификации Р123 с образованием Р110. При этом деэстерифицирующая активность была существенно выше в митохондриях астроцитов. Было выявлено, что преимущественно в митохондриях происходит модификация Р123 по эстеразному пути, что означает превалирование митохондриальных форм эстераз над цитозольными. Сравнение митохондрий, выделенных из обработанных Р123 клеток глиомы, и митохондрий, полученных из интактных клеток глиомы после их инкубации с Р123, указывает на то, что в митохондриях, выделенных по обоим протоколам, в дополнение к эстеразным модификациям обнаруживаются и другие типы модификации структуры родамина 123. При инкубации клеток глиомы с Р123 в присутствии ингибитора Р450, амиодарона, такая модификация структуры не наблюдалась. Модификация Р123 происходила во времени с уже накопленным в митохондриях Р123, и измененные структуры могли в разной степени выбрасываться из клетки через неспецифические попмпы. Масс-спектрометрический анализ в сочетании с жидкостной хроматографией высокого разрешения показал, что результатом модификации молекулы P123 является появление во времени двух мажорных флуоресцирующих компонентов с массой 214 и 579. Теоретически вторая компонента не может быть объяснена глюкуронированием Р123. Структуру низкомолекулярной компоненты надлежит выяснить. При нагрузке клеток митохондриально-направленным флуоресцентным катионом SkQR1 с последующим хроматографическим анализом было обнаружено несколько компонентов. При инкубации SkQR1 с клетками глиомы с последующей экстракцией третичным бутанолом менялись физико-химические параметры этих компонентов с появлением низкомолекулярных фрагментов, что говорило о серьезной модификации молекулы SKQR1. При ингибировании трансформации молекулы флуоресцентного зонда амиодароном было обнаружено исчезновение указанных низкомолекулярных компонентов. После инкубации клеток с SkQR1 и верапамилом, ингибитором неспецифических помп откачки из клетки, обнаружилось не только появление дополнительной фракции на хроматограмме, но и изменение степени модификации SKQR1 в направлении увеличения числа минорных модифицированных продуктов. Используя флуоресцентную микроскопию, мы показали, что в результате воздействия разобщителя флуоресценция Р123 в астроцитах резко уменьшается, в то время как в клетках глиомы она сохраняется даже через 24 часа. Эти результаты подтвердились при использовании проточной цитофлуориметрии. Попытка найти изменения спектральных свойств Р123 после инкубации с клетками не увенчалась успехом, однако было обнаружение уширение полос эмиссии SkQR1 после длительной 24-ч экстракции из клеток глиомы, что не наблюдалось при работе с астроцитами. Таким образом, мы показали, что клетки глиомы и астроциты обладают разной способностью модификации флуоресцентных зондов Р123 и SkQR1, что является важным заключением для потенциального использования этих веществ как диагностических и терапевтических агентов.
3 1 января 2020 г.-15 декабря 2020 г. Проблемы использования родаминовых красителей для оценки митохондриального мембранного потенциала в нормальных и опухолевых клетках.
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".