|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Принципы функционирования бифункциональных ДНК-метилтрансфераз. Особенности механизма взаимодействия С5-цитозиновой ДНК-метилтрансферазы SsoII с регуляторным и метилируемым участками узнавания в ДНКНИР
- Руководитель НИР: Рязанова А.Ю.
- Участники НИР: Никифорова Л.А., Норкин М.В., Тимофеева Н.А., Фадеев Я.С.
- Срок исполнения: 16 октября 2012 г. - 31 декабря 2013 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 12-04-32103 мол_а
- Номер ЦИТИС: 01201271312
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: другое
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
-
Рубрики ГРНТИ:
- 34.15.15 Пространственная структура и свойства биополимеров
- 34.15.17 Макромолекулярные ассоциации и проблемы узнавания в молекулярной биологии
-
Ключевые слова:
фактор транскрипции, днк-метилтрансфераза, бифункциональный белок, днк-белковые комплексы
-
Описание:
В основе развития всех живых организмов лежит точнейшая координация различных молекулярных событий во времени и в пространстве. Такая координация обеспечивается, в частности, полифункциональными белками, которые выступают в роли связующего звена между различными процессами. Данный проект направлен на разработку стратегии изучения полифункциональных белков, содержащих несколько ДНК-связывающих центров. В качестве объекта изучения выступает С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза SsoII (M.SsoII), которая помимо метилтрансферазной активности является еще и фактором транскрипции. Поскольку M.SsoII содержит только два домена, оба из которых являются ДНК-связывающими, она может служить удобной моделью для разработки общего подхода к изучению полифункциональных ДНК-связывающих белков. Задачей данного проекта является изучение тонкой структурной организации комплекса M.SsoII с операторным участком ДНК и оценка значения особенностей структуры этого комплекса для выполнения биологической роли M.SsoII, исследование взаимосвязи метилирующей и регуляторной активностей M.SsoII и построение модели функционирования M.SsoII в клетке.
-
Основные результаты:
Основной целью проекта была разработка стратегии изучения полифункциональных белков, содержащих несколько ДНК-связывающих центров. В качестве модельного объекта была выбрана ДНК-метилтрансфераза SsoII (M.SsoII) которая содержит только два домена, оба из которых являются ДНК-связывающими. Кроме функции метилирования ДНК M.SsoII выступает в роли фактора транскрипции. Она конкурирует с РНК-полимеразой, связываясь своим N-концевым доменом с регуляторным участком (15-звенной квазипалиндромной последовательностью) в промоторной области системы рестрикции–модификации (Р–М) SsoII. Предложенный в данной работе экспериментальный подход для характеристики различных многодоменных ДНК-связывающих белков включает в себя оценку термодинамических и кинетических параметров образования белково-нуклеиновых комплексов методом «торможения» в геле и методом «остановленного потока». Изучено комплексообразование M.SsoII с 60-звенными ДНК-дуплексами, содержащими регуляторный участок в различном окружении. Установлено незначительное влияние аденозиновых трактов (А4), фланкирующих регуляторный участок в природной последовательности ДНК и обеспечивающих изгиб ДНК на 9 градусов, на кинетику взаимодействия M.SsoII c ДНК и на эффективность комплексообразования. Показано, что взаимодействие M.SsoII с дуплексом, содержащим регуляторный участок, является двухстадийной реакцией, где первая стадия представляет собой собственно связывание, а вторая – конформационную перестройку белка в составе полученного комплекса. Реакция метилирования ДНК M.SsoII может быть описана схемой, состоящей из 4 стадий. Первая из них соответствует формированию ДНК-белкового комплекса, причем скорость этой стадии сравнима со скоростью связывания M.SsoII с ДНК, содержащей регуляторный участок. M.SsoII способна связывать ДНК, содержащую участок метилирования, и осуществлять «выпетливание» целевого остатка цитозина вне зависимости от наличия кофактора (AdoMet) или его аналога (AdoHcy) в реакционной смеси. Теоретически обосновано, что функционирование M.SsoII как фермента модификации SsoII обусловлено превалированием (на 4 порядка) участков метилирования над регуляторными участками в бактериальной клетке. Показано, что система Р–М SsoII может функционировать даже при наличии в клетке единственного регуляторного участка. Она настроена на функционирование при минимально возможных концентрациях белка и ДНК в широком диапазоне ионной силы, что дает ей преимущество в эволюционном плане.
- Добавил в систему: Рязанова Александра Юрьевна
Источник финансирования НИР
| грант РФФИ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 16 октября 2012 г.-31 декабря 2012 г. | Кинетика взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК, содержащей регуляторный участок |
| Результаты этапа: Методом «остановленного потока» изучена кинетика связывания ДНК-метилтрансферазы SsoII (M.SsoII) как с ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок, так и с ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования. Экспериментальные данные позволяют описать связывание M.SsoII с ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок, как двухстадийную реакцию. Определены значения констант скорости ассоциации и диссоциации для обеих стадий. Изучено комплексообразование M.SsoII с двумя 60-звенными ДНК-дуплексами, содержащими регуляторный участок, один из которых представляет собой точный фрагмент межгенной области системы рестрикции–модификации SsoII, а другой содержит замену аденинового тракта (блока из четырех остатков дезоксиаденозина подряд) на другую нуклеотидную последовательность. Эффективность связывания M.SsoII с этими ДНК-дуплексами одинакова в пределах ошибки эксперимента. Следовательно, адениновый тракт не играет определяющей роли при формировании комплекса M.SsoII с ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок. Проведена теоретическая оценка соотношения числа регуляторных участков и участков метилирования в бактериальной клетке. Показано, что M.SsoII выполняет функцию метилтрансферазы в первую очередь потому, что участков метилирования в клетке приблизительно в 20000 раз больше, чем регуляторных участков. Показано, что M.SsoII выступает в роли фактора транскрипции за счет того, что конкурирует с РНК-полимеразой за связывание с промоторной областью системы рестрикции–модификации SsoII. | ||
| 2 | 1 января 2013 г.-31 декабря 2013 г. | Кинетика взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК, содержащей участок метилирования |
| Результаты этапа: Основной целью проекта была разработка стратегии изучения полифункциональных белков, содержащих несколько ДНК-связывающих центров. В качестве модельного объекта была выбрана ДНК-метилтрансфераза SsoII (M.SsoII), которая содержит только два домена, оба из которых являются ДНК-связывающими. Кроме функции метилирования ДНК M.SsoII выступает в роли фактора транскрипции. Она конкурирует с РНК-полимеразой, связываясь своим N-концевым доменом с регуляторным участком (15-звенной квазипалиндромной последовательностью) в промоторной области системы рестрикции–модификации (Р–М) SsoII. Предложенный в данной работе экспериментальный подход для характеристики различных многодоменных ДНК-связывающих белков включает в себя оценку термодинамических и кинетических параметров образования белково-нуклеиновых комплексов методом «торможения» в геле и методом «остановленного потока». Изучено комплексообразование M.SsoII с 60-звенными ДНК-дуплексами, содержащими регуляторный участок в различном окружении. Установлено незначительное влияние аденозиновых трактов (А4), фланкирующих регуляторный участок в природной последовательности ДНК и обеспечивающих изгиб ДНК на 9 градусов, на кинетику взаимодействия M.SsoII c ДНК и на эффективность комплексообразования. Показано, что взаимодействие M.SsoII с дуплексом, содержащим регуляторный участок, является двухстадийной реакцией, где первая стадия представляет собой собственно связывание, а вторая – конформационную перестройку белка в составе полученного комплекса. Реакция метилирования ДНК M.SsoII может быть описана схемой, состоящей из 4 стадий. Первая из них соответствует формированию ДНК-белкового комплекса, причем скорость этой стадии сравнима со скоростью связывания M.SsoII с ДНК, содержащей регуляторный участок. M.SsoII способна связывать ДНК, содержащую участок метилирования, и осуществлять «выпетливание» целевого остатка цитозина вне зависимости от наличия кофактора (AdoMet) или его аналога (AdoHcy) в реакционной смеси. Теоретически обосновано, что функционирование M.SsoII как фермента модификации SsoII обусловлено превалированием (на 4 порядка) участков метилирования над регуляторными участками в бактериальной клетке. Показано, что система Р–М SsoII может функционировать даже при наличии в клетке единственного регуляторного участка. Она настроена на функционирование при минимально возможных концентрациях белка и ДНК в широком диапазоне ионной силы, что дает ей преимущество в эволюционном плане. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".