ИСТИНА

Предлагаемый проект направлен на разработку фундаментальной проблемы формирования в эволюции одного из особенных типов эукариотической клетки, свойственной споровикам. Для этого предполагается выделить клетки низших споровиков – паразитов насекомых и других беспозвоночных, а также других низших альвеолят, с помощью методов молекулярной филогенетики (с использованием нескольких молекулярных маркеров) определить их отношение к высшим споровикам, а затем наиболее интересные в эволюционном отношении виды подвергнуть более интенсивному исследованию. Споровики в учебниках зоологии традиционных считались особым типом из-за уникального устройства их цитоскелета. Ввиду исключительного медицинского и ветеринарного значения (как возбудители малярии, криптоспоридиоза, токсоплазмоза, пироплазмоза и других опасных заболеваний), они оказались одним из первых объектов геномых исследований среди эукариот. Однако все многочисленные виды споровиков – объектов геномных проектов, являются относительно близкими родственникам. В результате многие важные вопросы остаются не проясненными, поскольку «промежуточные» группы низших споровиков остаются мало изученными на ультраструктурном уровне и практически неизученными на молекулярном уровне.

Проведены экспериментальные работы по определению первичных структур генов, кодирующих белки цитоскелета, факторы трансляции, другие белки «домашнего хозяйства» одноклеточных эукариот, изучению молекулярного разнообразия паразитических протистов, в первую очередь споровиков, а также их свободноживущих гетеротрофных родственников. Работы были проведены по трем основным направлениям, если выделять их по таксономической принадлежности исследованных объектов. Первым объектом выступали кольпонемиды – не изученные ранее в молекулярном отношении хищные одноклеточные, предварительно рассматриваемые как сестринская (и в экологическом отношении предковая) группа апикомплекс и динофлагеллят. Последние две группы отличаются между собой в организации аппарата трансляции: тогда как споровикам свойственен наиболее распространенный у эукариот фактор элонгации 1А, у динофлагеллят его замещает паралог – EFL. Установление набора факторов трансляции у общего предка апикомплекс и динофлагеллят представляет несомненный интерес. В работе методом амплификации с использованием полимеразной цепной реакции с различными комбинациями EF1A-специфических и EFL-специфических праймеров выявлены гены EF1A у двух видов кольпонемид. Результат подтвержден определением нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов генов. Результаты исследования, после дополнения их сведениями о наборе факторов трансляции у кольподеллид – свободноживущих апикомплекс, будут представлены к печати. Вторым направлением работы было исследование паразитарной системы асептатных грегарин и их внутриклеточных паразитов микроспоридий. В распоряжении стажера был препарат суммарной ДНК из нескольких десятков клеток хозяина, собранных в ходе экспедиционных работ на Белом море. Оба таксона, асептатные грегарины и микроспоридии, характеризуются аномально высокой скоростью молекулярной эволюции, выявляемой, для микроспоридий, по многим белкам, а для грегарин – по рибосомным РНК, так как данные по другим их генам отсутствуют. Изучение белков цитоскелета обеих групп представляет интерес, так как у грегарин развивается особый тип скользящего движения клеток, а микроспоридии теряют клеточную подвижность. Стажером был амплифицирован протяженный фрагмент гена актина из препарата ДНК. Определение первичной структуры и ее анализ показали, что он принадлежит микроспоридии, причем является наименее измененным из микроспоридиальных генов актина, известным до сих пор. Это направление работ нуждается в продолжении, в частности, с использованием специфических праймеров, сконструированных в ходе исследований. Третьим объектом в работе выступали амебоафелидеи – протисты неясного систематического положения, внутриклеточные паразиты одноклеточных зеленых водорослей. Была выделена суммарная ДНК, с помощью полимеразной цепной реакции амплифицированы фрагменты гена актина, фактора элонгации и генов рРНК. Высокополимерные продукты реакции были очищены и клонированы в клетках кишечных палочек. После определения первичной структуры клонированных фрагментов среди них были найдены фрагменты генов хозяина и паразита, последние были подвергнуты детальному анализу. Установлено положение паразита на филогенетическом дереве протистов. В составе белок-кодирующих ядерных генов амебоафелидиума найдены многочисленные стоп-кодоны, однако они распределены не случайным образом, а соответствуют эволюционно консервативным глютаминам в кодируемых белках. Соответствующие стоп-кодоны переводятся в канонические для кодирования глютамина триплеты заменой одного нуклеотида. Это позволило сформулировать гипотезу, что клонированные участки генома являются не фрагментами псевдогенов, а отражают отклонение от универсального генетического кода, свойственное амебоафелидиуму (кодирование глютамина каноническим стоп-кодоном)