ИСТИНА

Современные достижения молекулярной биологии и развитие высокочувствительных методов в сочетании с визуализацией дали начало новому направлению – визуализации индивидуальных молекул в клеточных структурах in vivo. Важнейшее и уникальное свойство определения или визуализации in vivo - это возможность неинвазивно (или микроинвазивно) в условиях, приближенных к физиологическим, получить изображение и наблюдать динамику молекулярных событий в живых организмах. Этот подход активно развивается и успешно применяется в фармакологических и медико-биологических исследований человеческих заболеваний на надклеточном, клеточном и субклеточных уровнях. На сегодняшний день важной задачей современной науки является экспрессное, высокочувствительное, селективное и мультиплексное определение in vivo с последующей или симбатной визуализацией катехоламинов и их метаболитов, являющихся маркерами различных патологических процессов: нейродегенеративных деменций и нейроэндокринных опухолей, заболеваний сердечно-сосудистой системы, стресса и гибели. Следует отметить, что в этой области делаются только первые шаги, в настоящее время в литературе отсутствуют сведения о мультиплексном количественном определении маркеров нейромедиаторного обмена методами оптической визуализации в клеточных структурах. Основной целью настоящего проекта является решение новой комплексной задачи, а именно, создание 2D и 3D биосовместимых матриц на основе природных полимеров и белков (хитозана, коллагена, альгината, желатина и др.), которые бы одновременно являлись бы биосовместимой матрицей для выращивания клеточных культур (прежде всего париентальных клеток и нейронов), а также основой твердофазных индикаторных систем для мультиплексного определения in vivo катехоламинов и их метаболитов методами оптической визуализации (твердофазной флуоресцентной спектроскопии, флуоресцентной микроскопии и спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР-спектроскопии). В рамках проекта будут предложены мультиплексные флуоресцентные и ГКР-индикаторные системы, которые будут учитывать мешающее влияние компонентов живых клеточных структур, тканей, биологических жидкостей на интенсивность и воспроизводимость оптических сигналов (рассеяние, флуоресценция, поглощение), «прозрачность» биообъектов, а также нетоксичность применяемых реагентов и материалов, что позволит работать in vivo в живых системах. Достижение поставленных целей будет иметь фундаментальное значение для современной науки.

The modern achievements of molecular biology and the development of highly sensitive methods combined with visualization have given rise to a new scientific direction - the visualization of individual molecules in cellular structures in vivo. The most important and unique property of in vivo detection or visualization is the possibility of obtaining an image and observing the dynamics of molecular events in living organisms non-invasively (or microinvasively) in conditions that are close to physiological ones. This approach is actively developing and successfully applied in pharmacological and biomedical studies of human diseases at the supercellular, cellular and subcellular levels. To date, an important task of modern science consists in rapid, high sensitive, selective and multiplex in vivo determination with subsequent or simbital visualization of catecholamines and their metabolites, which are markers of various pathological processes: neurodegenerative dementias and neuroendocrine tumors, cardiovascular diseases, stress and death. It should be noted that only the first steps are now being taken in this area, at present there is no information in the literature on the multiplex quantitative determination of neurotransmitters by methods of optical imaging in cellular structures. The main goal of this project is to solve a new complex problem, namely, the creation of 2D and 3D biocompatible matrices based on natural polymers and proteins (chitosan, collagen, alginate, gelatin, etc.) that would simultaneously be a biocompatible matrix for growing cell cultures primarily parietal cells and neurons), as well as the basis of solid-phase indicator systems for the in vivo multiplex determination of catecholamines and their metabolites by optical imaging (solid-phase fluorescence spectra castrated, fluorescence microscopy and surface enhanced Raman spectroscopy (SERS)). In this project we propose development of multiplex fluorescent and SERS-indicator systems that will allow to prevent interfering effect of the components of living cellular structures, tissues, and biological fluids on the intensity and reproducibility of optical signals (Raman scattering, fluorescence, absorption). The proposed polymer structures will be "transparent" for bio-objects, and also non-toxic due to applied reagents and materials, what will allow to work in vivo in living systems. Achieving the set goals will be of fundamental importance for modern science.

1. Будут разработаны новые оптические биосовместимые системы с оптимальной архитектурой и составом 2D и 3D структур на основе гелей или пленок из природных полимеров, позволяющие сохранить целостность состава пробы биообъекта и нивелировать возможное мешающее влияние матрицы. 2. Будет подобрана наиболее подходящая конфигурация флуоресцентных и ГКР-индикаторных систем для регистрации воспроизводимого и стабильного во времени визуального (получаемого методами оптической микроскопии) аналитического сигнала от индивидуальных маркеров нейромедиаторного обмена (допамина, норадреналина, адреналина, норметанефрина, метанефрина, серотонина, 5-гидроксииндолуксусной кислоты, 3,4-дигидрокси-L-фенилаланина, ванилилминдальной и гомованилиновой кислот), а также их смесей на фоне матриц реальных биологических объектов (тканях, биологических жидкостей, клеточных структур). 3. Будет изучена возможная токсичность компонентов индикаторных систем на живые ткани, клеточные структуры.

Коллектив заявителей имеет значительный научный задел по созданию твердофазных флуоресцентных сенсорных устройств и индикаторных систем на основе гелей и пленок из природных полимеров для определения биологически активных соединений различных классов. За последние несколько лет в результате исследований получены и детально изучены оптические пленки и гели на основе природных полимера – хитозана, с импрегнированными в них распознающими молекулами (индикаторными веществами, комплексами с ионами металлов, ферментами); а также с молекулярными отпечатками. Созданы твердофазные оптические (фотометрические, флуориметрические) сенсоры на основе тирозиназы, лакказы, пероксидазы из корней хрена, иммобилизованных в слое полимера хитозана, для определения фенолов, катехоламинов, белков, флавоноидов, серосодержащих соединений, органических пероксидов различного строения. Направленно подобраны оптимальные биокатализаторы, индикаторные вещества, дериватизирующие агенты, условия формирования металлокомплексов, обеспечивающие высокий и воспроизводимый аналитический сигнал пленок и гелей в водных, водно-органических и мицеллярных средах, используемых в подготовке проб реальных объектов. Структура получаемых сенсорных материалов изучена методами спектрофотометрии, флуоресценции, ИК–спектроскопии, масс-спектрометрии, атомно-силовой и сканирующей электронной микроскопии. Предварительные результаты обеспечивают чувствительность определения маркеров нейромедиаторного обмена в модельных растворах на уровне 1 фМ. Коллективу предлагаемого проекта доступны: спектрофлуориметры Shimadzu и Agilent ExVarian; вижуалайзер Camag TLC Vizualizer 2; КР-спектрометер InVia Reflex (Renishaw) с аргоновым, диодным и твердотельным источниками, оснащенный термоаналитическим столиком; спектрофотометр Shimadzu; металлографический микроскоп Eclipse 600pol (Nikon) с термостоликом; ИК-спектрометр с Фурье-преобразованием и др.

1. Разработаны новые оптические биосовместимые системы с оптимальной архитектурой и составом 2D и 3D структур на основе гелей и пленок из природных полимеров(хитозан, коллаген, желатин, альгинат, альбумин), позволяющие сохранить целостность состава пробы биообъекта и нивелировать влияние матрицы. 2. Подобрана наиболее подходящая конфигурация флуоресцентных и ГКР-индикаторных систем для регистрации воспроизводимого и стабильного во времени визуального (получаемого методами оптической микроскопии) аналитического сигнала от индивидуальных маркеров нейромедиаторного обмена (допамина, норадреналина, адреналина, норметанефрина, метанефрина, серотонина, 5-гидроксииндолуксусной кислоты, 3,4-дигидрокси-L-фенилаланина, ванилилминдальной и гомованилиновой кислот), а также их смесей на фоне матриц реальных биологических объектов (мочи, крови, клеточных культур). 3. Изучена токсичность компонентов индикаторных систем на клеточные культуры. 4. На примере использования гибридной системы из 2D альгинатных и 3D коллагеновых структур определили концентрацию допамина в клеточных культурах феохромоцитомы крысы. 5. На примере использования 2D хитозановых структур определили концентрации маркеров нейромедиаторного обмена в моче человека, плазме крови мышей и крыс, клеточных культурах рака кишечника человека.