В связи с техническими работами в центре обработки данных, возможность загрузки и скачивания файлов временно недоступна.
 

Влияние мутаций бактериальных бета-лактамаз на пластичность структуры, механизм действия, изменение субстратной специфичности и формирование резистентности к бета-лактамным антибиотикамНИР

Effect of mutations in bacterial beta-lactamases on structure plasticity, mechanisms of action, substrate specificity and development of resistance to beta-lactam antibiotics

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 2 марта 2015 г.-31 декабря 2015 г. Влияние мутаций бактериальных бета-лактамаз на пластичность структуры, механизм действия, изменение субстратной специфичности и формирование резистентности к бета-лактамным антибиотикам
Результаты этапа: Проведен сбор нуклеотидных и белковых последовательностей бета-лактамаз ТЕМ типа в международных банках данных. Бета-лактамазы ТЕМ-типа относятся к наиболее распространенному в настоящее время молекулярному классу А. Семейство бета-лактамаз ТЕМ-типа включает в настоящее время 205 субтипов (вариантов) ферментов. Белок содержит 288 аминокислот. Общее число аминокислот, в которых наблюдались замены – 92, из них 5 находятся в сигнальной последовательности. Эволюция этих ферментов является самой продолжительной по времени, при этом они относятся к наиболее часто мутируемым из всех описанных типов бета-лактамаз. У белков данного типа имеется несколько так называемых ключевых мутаций, приводящих к расширению спектра субстратной специфичности. Только у этого типа бета-лактамаз выявлено 5 положений, мутации в которых приводят к появлению мутантных форм, устойчивых к ингибиторам. Выполнено компьютерное моделирование бета-лактамазы ТЕМ-1. На модели фермента проведен анализ расположения мутирующих аминокислотных остатков, соответствующим изменению профиля субстратной специфичности, устойчивости к действию ингибиторов, а также остатков, для которых пока не установлено значение мутаций. Проведен анализ расположения этих остатков на модели белка, а также возможного влияния замещающих аминокислот на изменение внутрибелковых связей и стабильность белковой глобулы. Выявлены положения, мутации в которых могут повлиять на стабильность белковой глобулы. Проведено клонирование и экспрессия в клетках E.coli генов бета-лактамаз ТЕМ-1 и ее мутантов, содержащих единичные ключевые мутации и их комбинации в положениях 39, 84, 104, 164. Разработаны методы выделения и очистки рекомбинантных мутантных форм бета-лактамаз, получены гомогенные препараты рекомбинантных ферментов бета-лактамаз TEM-1 и ТЕМ-171, отличающихся заменой валина на изолейцин в положении 84 (Val84Ile). Поведено изучение каталитических свойств и термостабильности рекомбинантных бета-лактамаз ТЕМ-1 и ТЕМ-171. Методами ферментативной кинетики определены значения КM и kкат для рекомбинантных форм бета-лактамаз по субстрату CENTA. Они практически не отличались, что позволило сделать вывод о схожести строения каталитического центра и одинаковой каталитической эффективности обоих рекомбинантных ферментов в реакции гидролиза субстрата CENTA. Это свидетельствует о том, что замена валина в 84 положении на изолейцин не оказывает существенного влияния на конформацию активного центра фермента и пути передачи протона. Было изучено ингибирование рекомбинантных бета-лактамаз TEM-1 и ТЕМ-171 тазобактамом. Для обоих ферментов установлен конкурентный тип ингибирования бета-лактамаз ТЕМ-1 и ТЕМ-171 тазобактамом в отношении субстрата CENTA. Данный факт отражает структурное сходство тазобактама с бета-лактамными антибиотиками (пенициллины и цефалоспорины), являющимися субстратами бета-лактамаз. Изучение термостабильности бета-лактамаз TEM-1 и ТЕМ-171 при 60 0С показало, что замена валина в 84 положении на изолейцин приводит к уменьшению стабильности фермента ТЕМ-171 в 1,5 раза. Разработан метод определения уровня мРНК бета-лактамаз на основе обратной транскрипции и гибридизации со специфическими олигонуклеотидными зондами. Оптимизированы условия выделения мРНК из культур клеток E.coli. Оптимизированы условия удаления примеси дезоксирибонуклеиновых кислот. Оптимизированы условия проведения обратной транскрипции в присутствии ревертаз различного происхождения. Проведен молекулярный дизайн олигонуклотидных зондов для идентификации генов бета-лактамаз ТЕМ типа. Оптимизированы условия идентификации генов бета-лактамаз с использованием различных участков специфического гена.
2 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Влияние мутаций бактериальных бета-лактамаз на пластичность структуры, механизм действия, изменение субстратной специфичности и формирование резистентности к бета-лактамным антибиотикам
Результаты этапа: Основная цель проекта заключается в исследовании влияния точечных мутаций и их комбинаций на изменение структуры, субстратной специфичности и физико-химических свойств бактериальных ферментов бета-лактамаз ТЕМ типа.Для экспериментального исследования в 2016 году было выбрано изучение влияния сопутствующих замен Q39K и М182Т на каталитические свойства и стабильность бета-лактамаз ТЕМ типа. В результате выполнения работы созданы девять штаммов E.coli - продуцентов мутантных форм бета-лактамазы ТЕМ-1, содержащих единичные аминокислотные замены (сопутствующие Q39K, M182T, ключевые M69V, E104K, R164S) и их комбинации (Q39K+ E104K, Q39K+ M69V, Q39K+ R164S, Q39K+R164S+E104K). Для всех полученных рекомбинантных мутантных форм бета-лактамазы ТЕМ-1 проведено определение значений KM хромогенного субстрата CENTA, являющегося синтетическим хромогенным субстратом бета-лактамаз. У двойных мутантов, включающих замену Q39K и одну из трех ключевых мутаций, наблюдали во всех случаях уменьшение Км, т.е. улучшение связывания субстрата, по сравнению с единичной ключевой заменой. Впервые было проведено исследование термоинактивации полученных мутантных форм бета-лактамазы ТЕМ-1 при повышенной температуре. Единичная замена M182T уменьшала скорость термоинактивации, т.е. приводила к стабилизации фермента. Для всех сочетаний сопутствующей мутации Q39K с ключевыми M69V, E104K, R164S был выявлен кумулятивный эффект, заключающийся в дестабилизирующем влиянии замены Q39K на стабильность фермента. Это свойство данной замены было показано впервые. Впервые показано стабилизирующее влияние замены R164S на способность фермента к термореактивации. Проведено компьютерное моделирование комплексов бета-лактамаз ТЕМ типа с различными лигандами. Объяснено уменьшение КМ при взаимодействии бета-лактамазы с субстратом СЕНТА. Проведено генотипирование образцов ДНК, выделенных из возбудителей выделенных из внутрибольничных и внебольничных штаммов энтеробактерий на наличие генов бета-лактамаз методом гибридизационного анализа на микрочипах с ферментативной детекцией. Показаны преимущества данного метода для экспресс-идентификации генов, обуславливающих устойчивость возбудителей к бета-лактамным антибиотикам. Выявлены сходства и различия в генах бета-лактамаз, выявляемых у возбудителей внутри- и внебольничных инфекций. Полученные результаты будут использованы для поиска новых способов предоления антибиотикорезистентности и разработки новых эффективных способов определения устойчивых к антибиотикам бактерий.
3 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Влияние мутаций бактериальных бета-лактамаз на пластичность структуры, механизм действия, изменение субстратной специфичности и формирование резистентности к бета-лактамным антибиотикам
Результаты этапа: В результате работы были созданы четырнадцать штаммов E.coli - продуцентов мутантных форм бета-лактамазы ТЕМ-1: продуценты мутантных форм бета-лактамазы ТЕМ-1, содержащих единичные аминокислотные замены по положениям 165 (три варианта замен), 167 (два варианта замен), 174 (два варианта замен), 276 (одна замена), 265 (единичная замена и четыре комбинации), комбинацию мутаций R164S и M182T. Для всех полученных рекомбинантных мутантных форм бета-лактамазы ТЕМ-1 проведено определение значений KM и Vmax гидролиза хромогенного субстрата CENTA, являющегося синтетическим хромогенным субстратом бета-лактамаз. Значения KM и Vmax для некоторых вариантов ТЕМ бета-лактамаз получены впервые. Проведено компьютерное моделирование комплексов бета-лактамаз ТЕМ типа с различными лигандами (субстратами цефалотин и CENTA и ингибиторами сульбактам, тазобактам, клавулановая кислота) методом молекулярной динамики на удлиненных траекториях (десятки наносекунд). В качестве модельных бета-лактамаз использованы две бета-лактамазы: TEM-1 и ТЕМ-32 (замены М69I, М182Т), относящегося к фенотипу ингибитор-устойчивых бета-лактамаз. С помощью программного комплекса AMBER рассчитывалась свободная энергия образования комплексов. Полученные данные показали, что половина изученных комплексов распадается спустя 1-2 нс после начала траектории. Сравнение свободных энергий комплексов, которые оставались стабильными на протяжении всей траектории (10 нс) позволило расположить исследованные соединения ряд по убыванию стабильности комплексов с бета-лактамазой TEM-1: клавулановая кислота, тазобактам, CENTA. Свободные энергии комплексов TEM-32 с CENTA и цефалотином близки, и они выше, чем свободная энергия комплекса TEM-1/CENTA, что свидетельствует о более высокой аффинности исследованных соединений к TEM-1 по сравнению с ферментом TEM-32. Проведён структурный и энергетический анализ двух конформаций омега-петли у бета-лактамаз семейства ТЕМ. Изменение геометрии петли происходит за счёт мутации R164S, которая вызывает перестройку системы водородных и ионных связей, образованную боковыми цепями аминокислотных остатков, образующих омега-петлю. Анализ флуктуаций тяжелых атомов аминокислотных остатков показал, что в бета-лактамазе ТЕМ-1 движение омега-петли происходит в направлении от первоначального положения к «открытому» состоянию. Введение мутации R164S приводит как к увеличению, так и понижению подвижности различных аминокислотных остатков. Омега- петля отклоняется от первоначального положения и свободно смещается от «открытого» до «закрытого» состояния. Последующее введение мутации в положении 39 приводит к дополнительному увеличению подвижности различных элементов белковой глобулы в целом, а омега-петля закрепляется в закрытом положении. Для установления механизмов влияния удаленных остатков на структурные элементы, в частности, на омега-петлю, были построены сети внутрибелковых взаимодействий аминокислотных остатков (RIN) на основании данных траекторий молекулярной динамики для шести структур бета-лактамаз TEM-1; ТЕМ-1 с ключевыми заменами G238S и E240K (аналог природной бета-лактамазы ТЕМ-71); ТЕМ-1 с тремя заменами G238S, E240K, M182T; TEM-1 с четырьмя заменами G238S, E240K, M182T, Q39K (аналог природной бета-лактамазы TEM-72); ТЕМ-1 с заменой R164S; ТЕМ-1 с двумя заменами R164S и Q39K. Показано, что в результате точечных мутаций в ферменте происходит исчезновение отдельных контактов и появление новых, что может существенно менять подвижность фрагментов белковой глобулы, участвующих в катализе, и влиять на каталитические свойства ферментов. Проведено исследование влияния условий наращивания клеток E. сoli – продуцентов рекомбинантных бета-лактамаз на экспрессию генов бета-лактамазы ТЕМ- 1 и ее мутантных форм. Установлено, что уровень РНК-транскриптов бета-лактамаз ТЕМ типа, определяемый по выходу ПЦР-продукта специфического гена бета-лактамаз ТEM типа, не зависел от концентрации антибиотика к культуре клеток. Изучено влияние структуры праймеров и типа ревертазы на эффективность реакции обратной транскрипции и выбраны специфические праймеры, обеспечивающие максимальный выход реакции синтеза кДНК. Проведен анализ ДНК и РНК, выделенных из клинических нтаммов энтеробактерий с разной степенью устойчивости к бета-лактамеым антибиотикам. Показано, что количество экспрессируемых генов в мультирезистентных штаммах было меньше количества обнаруженных в ДНК генов.
4 16 апреля 2018 г.-31 декабря 2018 г. Влияние мутаций бактериальных бета-лактамаз на пластичность структуры, механизм действия, изменение субстратной специфичности и формирование резистентности к бета-лактамным антибиотикам
Результаты этапа: 1. Проанализированы литературные данные по механизмам резистентности бактерий к антибиотикам; распространенности резистентных бактерий; участию бактериальных ферментов в реализации резистентности, структуре и свойствам бета-лактамаз. Проведена систематизация бактериальных ферментов, участвующих в формировании резистентности. 2. Проведён биоинформатический анализ разрешённых на настоящее время пространственных структур сериновых бета-лактамаз разных с целью изучения укладки и пространственного расположения омега-петли. Показано, что укладка омега-петли близка у разных сериновых ферментов, что объясняется консервативностью структуры, малой подвижностью и незначительными вариациями расстояния между N- и C-концами петли. Конформация петли определяется взаимодействием остатков петли друг с другом и с растворителем, и в меньшей степени с остальной частью белковой глобулы. 3. Используя метод молекулярной динамики проведён сравнительный анализ динамических свойств омега-петли и энергии её взаимодействия с белковой глобулой и растворителем. Схожесть укладки омега-петли у сериновых бета-лактамаз, её расположение вблизи активного центра, высокая гомология последовательностей петли позволяет рассматривать этот элемент структуры белка как новую мишень для аллостерического воздействия на ферментативную активность с целью его ингибирования. 4. Созданы штаммы E.coli – продуценты рекомбинатных бета-лактамаз ТЕМ типа, содержащие единичные замены R65L и М182А, а также двойной мутант R65L+М182Т. Мутант R65L характеризовался низкой периплазматической концентрацией целевого белка. У мутанта с двойной заменой R65L+M182T уровень синтеза про-белка и концентрация зрелого белка в периплазме соответствует ферменту дикого типа ТЕМ-1. Это свидетельствует о компенсации дестабилизирующего влияния замены R65L в сочетании с мутацией M182T. 5. Изучены каталитические свойства рекомбинантных бета-лактамаз, содержащих единичные мутации R65L, M182A, М182Т и комбинацию мутаций R65L+М182Т, в отношении антибиотиков пенициллина, цефалотина, цефтазидима и хромогенного субстрата CENTA. Мутации остатков 65 и 182 не приводят к расширению профиля субстратной специфичности по сравнению с нативным ферментом ТЕМ-1: сохраняется ферментативная активность в отношении пенициллина и цефалоспоринов I поколения (цефалотин, CENTA), отсутствует активность в отношении цефтазидима (цефалоспорин III поколения). Отличие наблюдается только в пониженной каталитической эффективности гидролиза хромогенного субстрата CENTA, являющегося произфодным цефалотина, в основном, вследствие снижения значения kкат. Пониженная каталитическая активность может быть связана с увеличенной подвижностью омега-петли. 6. Изучена термодинамическая стабильность и термоинактивация полученных рекомбинантных форм бета-лактамаз ТЕМ типа. Замена R65L приводит к резкому уменьшению стабильности фермента; замена M182T приводит к повышению термостабильности и способности к ренатурации; замена M182A на начальном участке кривой инактивации сравнимо с термостабильным мутантом M182T, однако при более длительной инкубации становится сравнимой по стабильности с ферментом дикого типа ТЕМ-1; фермент с двойной заменой R65L+М182Т проявляет наибольшую способность к ренатурации и по этому параметру является наиболее термоустойчивой по сравнению с другими мутантными формами. 7. Расшифрована кристаллическая структура бета-лактамазы ТЕМ-171. Бета-лактамаза TEM-171 представляет клинически значимый мутант, отличающийся заменой V84I от фермента TEM-1. Гидроксильная группа каталитического остатка серина 70 образует тетраэдрическую структуру с тремя молекулами воды. 8. Впервые для бета-лактамаз ТЕМ типа расшифрованы две структуры комплекса ТЕМ-171/тазобактам (I и II), отличающиеся разными временами насыщения кристаллов растворами тазобактама. В комплексах I и II интермедиат тазобактама ковалентно связан с каталитическим остатком S70 в транс-енаминной конфигурации. Структура белка в комплексе I практически идентична нативной структуре, а конформация интермедиат тазобактама похожа на структуру ранее полученную для β-лактамазы GES-2. В комплексе II, полученном после более длительной инкубации нативных кристаллов в растворе ингибитора, интермедиат тазобактама образует больше связей с активным центром фермента, и его конформация стабилизируется дополнительным стекинг взаимодействием с Y105, что подтверждается данными по тушению флуоресценции. Полученные результаты создают дополнительную структурную основу для рационального дизайна новых ингибиторов бета-лактамаз молекулярного класса А. 9. Проведена оптимизация методик выделения рРНК из клинических штаммов и методики получения кДНК методом обратной транскрипции. Показана необходимость включения дополнительных контролей чистоты препаратов выделенной РНК и реагентов, используемых для амплификации генов, на наличие примесной ДНК бета-лактамаз. Экспериментальные исследования разработанной методики применены для трех клинических штаммов бактерий K. рneumonia, которые культивировали в присутствии бета-лактамных антибиотиков, а также без антибиотика. Проведен сравнительный анализ профилей ДНК и РНК-транскриптов бета-лактамаз у выбранных клинических штаммов K. Рneumonia. Анализ РНК-транскриптов показал различный уровень экспрессии бета-лактамаз разных типов в зависимости от локализации гена и наличия антибиотика в среде.
5 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Влияние мутаций бактериальных бета-лактамаз на пластичность структуры, механизм действия, изменение субстратной специфичности и формирование резистентности к бета-лактамным антибиотикам
Результаты этапа: 1. Проведен анализ научной литературы и баз данных последовательностей бета-лактамаз о структуре и свойствах сериновых бета-лактамаз TEM-типа, относящихся к молекулярному классу А. Локализация остатков, мутации которых приводят к изменению активности и специфичности бета-лактамаз, в петлях белковой глобулы обуславливает интерес к ним как к потенциальным объектам для воздействия на фермент. Одной из функционально важных петель является омега–петля, образованная остатками Arg164-Asp179 и расположенная на стыке 2-х доменов в нижней части входа в активный центр фермента. Конформация омега–петли определяет субстратную специфичность ферментов этого класса. Данная петля встречается у бета-лактамаз различных молекулярных классов, ее пространственная укладка похожа у разных ферментов, она обращена во внешнюю среду и является иммуногенной. В рамках настоящего Проекта омега–петля рассматривается как новая аллостерическая мишень для направленного воздействия на бета-лактамазы с целью ингибирования активности. 2. Проведена систематизация рабочей коллекции мутантных форм бета-лактамаз ТЕМ типа, включающей 36 штаммов E.coli, продуцирующих 30 вариантов рекомбинантных бета-лактамаз ТЕМ типа (молекулярный класс А), 3 варианта бета-лактамаз СТХ-М типа (молекулярный класс А), 2 варианта карбапенемаз – VIM-4 и NDM-1 (молекулярный класс В).Коллекция штаммов-продуцентов включена в Депозитарий живых систем Проекта Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова "Ноев Ковчег". 3. С целью оптимизации условий кристаллизации были наработаны препаративные количества бета-лактамаз ТЕМ типа: (ТЕМ-1; ТЕМ-12, содержащей замену R164S; ТЕМ-18, содержащей замены Q39K+ E104K; бета-лактамаза, содержащая замены R65L+M182T; и бета-лактамаза с заменой M182E). 4. Оптимизированы условия кристаллизации орторомбической кристаллической формы бета-лактамаз ТЕМ типа. Полученные кристаллы бета-лактамаз принадлежали к пространственной группе P212121 с параметрами элементарной ячейки a=42.27 b=63.46 c=89.77, α=β=γ=90°, что совпадает с литературными данными. 5. Методами молекулярной динамики исследованы изменения структуры, подвижности и внутрибелковых взаимодействий у бета-лактамаз ТЕМ типа с мутациями в положении 244 и сочетанием мутаций в положениях 104 и 39, для которых ранее экспериментально было показано, соответственно, существенное падение каталитической активности и термостабильности. Для этого были рассчитаны значения среднеквадратичных отклонений (RMSD) и флуктуаций (RMSF) аминокислотных остатков, а также количество образующихся водородных связей. Из полученных траекторий МД было выделено по 50 «промежуточных» усредненных конформаций исследуемых белков, на основе которых были построены и проанализированы сети внутрибелковых взаимодействий (RIN). Для ключевых участков белка были построены отдельные карты RIN и предложены пути передачи сигнала от мутированных остатков до остатков активного центра и омега-петли. 6. Исследовано динамическое поведение бета-лактамазы ТЕМ-1 в трех комплексах с синтетическим хромогенным субстратом CENTA, являющимся производным антибиотика цефалотина: перед каталитическим актом, в фермент-субстратном комплексе и с продуктом его гидролиза. В ходе динамики наблюдали процесс выхода продукта реакции из активного центра фермента: на первом этапе наблюдали формирование пи-стекинг взаимодействия продукта с остатоком Tyr105, которое потом разрывалось, способствуя выходу продукта, второе изменение контактов касалось образования и потом разрыва водородной связи продукта с остатком омега-петли Glu166. Появление новой водородной связи продукта гидролиза с данным остатком, по-видимому, способствует выходу его из активного центра. Это согласуется с ранее полученными данными рентгеноструктурного анализа о строении интермедиатов комплекса ингибитора тазобактама в активном центре бета-лактамазы ТЕМ-171 и об участии остатка Tyr105 в стэкинг-взаимодействии с молекулой тазобактама. 7. Осуществлён подбор специфических праймеров для проведения амплификации гена, кодирующего двух химерных конструкций, состоящей из омега-петли бета-лактамазы ТЕМ-1 и белка-носителя (БСЖК – белок, связывающий жирные кислоты), соединённых линкерной последовательностью (Gly4Ser)3. Проведено клонирование соответствующих генов в экспрессионный вектор системы рЕТ. Созданы рекомбинатные штаммы E.coli – продуценты химерных белков на основе БСЖК, содержащих омега-петлю. Разработана методика выделения и очистки, позволяющая получать 30 мг целевого рекомбинантного препарата БСЖК-омега-петля с 1 литра культуры клеток E.coli. 8. Проведён новых аллостерических ингибиторов бета-лактамаз методом виртуального скрининга in silico с использованием нескольких библиотек низкомолекулярных лигандов. В качестве мишени в структуре бета-лактамазы ТЕМ типа найден потенциальный аллостерический сайт, расположенный рядом с омега-петлей. Проведен рациональный химический дизайн производных феноксианилинов и тиомочевины для поиска новых ингибиторов аллостерического центра, выявленного на первом этапе Проекта. При изучении их нигибирующей способности были выявлены следующие закономерности: изменение заместителей в арильном фрагменте молекулы приводит к снижению ингибирующей активности лиганда; оптимальная длина углеводородородного фрагмента соответствует двум атомам углерода. Лучшую ингибирующую активность показали четыре производных тиомочевины, являющиеся хлор-производными. 9. Проведена оптимизация гибридизационного анализа на биочипах низкой плотности с колориметрической детекцией на основе пероксидазы хрена для количественного определения уровня экспрессии генов бета-лактамаз ТЕМ типа. Проведена оптимизация метода количественной обработки гибридизационных сигналов для увеличения динамического диапазона их значений. Изучены пять математических алгоритмов цифрового перевода оттенков синего цвета в шкалу оттенков серого цвета. Применение данного алгоритма позволило увеличить шкалу сигналов на примерно 30 % по сравнению с ранее использованным алгоритмом. Проведена оптимизация структуры специфического олигонуклеотидного зонда. Получена градуировочная зависимость интенсивности гибридизационных сигналов от концентрации мРНК бета-лактамаз ТЕМ типа в лабораторном штамме E. сoli. В качестве контроля экспрессии бета-лактамазы определяли активность фермента в периплазматических фракциях, выделенных из этих же клеток, в реакции гидролиза антибиотика ампициллина. Метод апробирован с использованием набора образцов мРНК, выделенных их трех клинических штаммов K. pneumoniae, устойчивых к разным бета-лактамным антибиотикам.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".