Получение вирусоподобных частиц на основе экспрессированного в бактериальных клетках белка оболочки вируса растения и сравнительный анализ их структурыНИР

Virus-like particles obtaining by the expression of plant virus coat protein in bacterial cells and a comparative analysis of their structure

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 14 марта 2018 г.-19 марта 2019 г. Получение вирусоподобных частиц на основе экспрессированного в бактериальных клетках белка оболочки вируса растения и сравнительный анализ их структуры
Результаты этапа: В ходе выполнения проекта были созданы генетические конструкции, содержащие ген БО ВМАльт для экспрессии его в бактериальных клетках E. coli, а также генетические конструкции для экспрессии в бактериальных клетках рекомбинантного БО ВМАльт, содержащего в своем составе эпитоп из 14 аминокислотных остатков (RV14) белка VP6 РВ. Этот эпитоп представляет собой 14 аминокислотных остатков (RV14) белка VP6 РВ (последовательность Arg-Leu-Ser-Phe-Gln-Leu-Met-Arg-Pro-Pro-Asn-Met-Thr-Pro) и является важным фактором индукции иммунного ответа против ротавирусной инфекции. Ген, кодирующий рекомбинантный БО ВМАльт, был получен методом ПЦР на матрице ранее полученной в лаборатории плазмиды pAl3005v2, содержащей кДНК копию генома ВМАльт (штамм MU). Дизайн праймеров, необходимых для проведения ПЦР, осуществляли вручную, используя известные нуклеотидные последовательности. Использовали on-line приложение OligoCalc (http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html) для определения температуры отжига праймеров. Анализ возможности образования олигонуклеотидами вторичных структур, понижающих эффективность ПЦР, специфичности праймеров к соответствующим участкам ДНК и возможности их неспецифического отжига проверяли также с использованием программы Vector NTI Advance® 11.0 («Thermo Fisher Scientific», США). Синтез олигонуклеотидов был осуществлен компанией «Синтол» (Россия). Поскольку проводить экспрессию рекомбинантного белка предполагалось в бактериальной системе, нуклеотидная последовательность, кодирующая БО ВМАльт, была оптимизирована: кодоны, которые редко встречаются в геноме E. coli, а следовательно, будут снижать эффективность синтеза белка, были заменены на синонимичные, но с большей частотой встречаемости (https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table): Ile 13(ata) на Ile 13(att), Arg 100(aga) на Arg 100(cgc), Arg 110(aga) на Arg 110(cgc), Arg 153(agg) на Arg 153(cgc), Arg 160(aga) на Arg 160(cgc). Кроме того, был заменен кодон Ser 2(tcc) на Ser 2(agt) по техническим соображениям, так как первые четыре нуклеотида кодирующей последовательности входят в состав сайта рестрикции PagI. Синонимичные замены были внесены с помощью четырех последовательных ПЦР с использованием праймеров, содержащих замены. ПЦР проводили в объеме 50 мкл, содержащем 50-60 нг ДНК-матрицы, 1х буфер Encyclo («Евроген», Россия), смесь нуклеозидтрифосфатов (0,2 мМ каждого), 1х смесь полимераз Encyclo («Евроген», Россия) и по 20 пкмоль каждого праймера. Амплификацию проводили в термоциклере Терцик («ДНК-технология», Россия). При несовпадении температур отжига праймеров использовали меньшую температуру. Для предотвращения испарения реакцию проводили под минеральным маслом. Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза нуклеиновых кислот в агарозном геле, после чего выделяли из агарозного геля (набор «Gel Extraction Kit» фирмы «Thermo Fisher Scientific» (США) согласно протоколу). Конечный продукт четырех последовательных ПЦР (ПЦР4) был лигирован в плазмидный вектор pQE-30 по сайтам рестрикции BamH1 и HindIII, что позволило добавить на N-конец БО ВМАльт последовательность из шести гистидиновых остатков, необходимых для выделения и очистки белка интереса. Лигирование проводили в объеме 35 мкл, содержащем 1-кратный буфер для Т4-ДНК лигазы, 0,2мМ АТФ, 1 единицу Т4-ДНК лигазы («Fermentas»), 0,6 мкг ДНК. Смесь инкубировали в течение 1 часа при температуре 16°С. Для создания генетической конструкции для экспрессии в клетках E. coli рекомбинантного БО ВМАльт, содержащего в своем составе эпитоп из 14 аминокислотных остатков (RV14) белка VP6 РВ, был также использован продукт ПЦР4, так как он уже содержал последовательность нуклеотидов, оптимизированную для продукции белка в бактериальной системе. В качестве исходной антигенной детерминанты для создания прототипа вакцины был выбран эпитоп ротавирусного белка VP6, содержащий аминокислотные остатки с 289 по 302, так как, согласно данным литературы, он способен активировать сильный протективный иммунный ответ, сравнимый с иммунным ответом, созданным при иммунизации собственно белком VP6 (Choi et al., 2000). Данный участок является консервативным для ряда штаммов группы A (Parbhoo et al., 2015) и является многообещающей антигенной детерминантой для разработки вакцин против ротавирусной инфекции. С помощью метода ПЦР, используя праймер, содержащий нуклеотидную последовательность эпитопа белка VP6 ротавируса, последовательность этого эпитопа была слита с последовательностью БО ВМАльт таким образом, чтобы эпитоп оказался на C-конце синтезируемого белка. Решение добавить эпитоп ротавируса именно на C-конец БО ВМАльт было основано на работе Tremblay с соавторами (2006), продемонстрировавших, что C-конец БО близкородственного вируса – вируса мозаики папайи – в составе ВПЧ, экспонирован наружу. Таким образом, можно было рассчитывать, что у БО ВМАльт он тоже будет снаружи, и, следовательно, наличие эпитопа ротавируса будет меньше влиять на сборку белка, а сам эпитоп будет более доступен для факторов иммунной системы. Концевые праймеры содержали последовательности сайтов рестрикции, фланкирующие нуклеотидную последовательность гена химерного белка (сайт PagI на 5’-конце гена и сайт BamHI – на 3’-конце), необходимых для последующего клонирования гена в плазмиду. Итоговый продукт ПЦР (ПЦР 5) был обработан соответствующими эндонуклеазами рекстрикции (PagI и BamHI) и лигирован с вектором. В качестве вектора была использована плазмида pQE-60, строение которой позволяет добавить содержащеюся в ее составе последовательность из шести гистидиновых остатков на C-конец белка интереса, и тем самым выделить и очистить белок. Плазмида была разрезана эндонуклеазами рестрикции BamHI и NcoI. Использование PagI для разрезания вектора было нецелесообразным, так как pQE-60 содержит три сайта разрезания PagI. В то же время, при обработке вектора pQE-60 рестриктазой NcoI, а вставки (итогового ПЦР-продукта) – рестриктазой PagI получаются идентичные выступающие 5’-концы, что позволило успешно лигировать продукты разрезания этими эндонуклеазами рестрикции друг на друга. Продукт ПЦР5 был использован для дальнейшей интеграции в плазмидный вектор, в результате которой была получена плазмида, содержащая ген рекомбинантного БО ВМАльт слитого c эпитопом ротавирусного белка VP6 и шестью остатками гистидина на C-конце, необходимыми для выделения и очистки белка. Данный белок был назван ER6 (Epitope of Rotavirus protein VP6). Аналогичным методом была получена конструкция с геном рекомбинантного БО ВМАльт, слитого c эпитопом ротавируса и шестью остатками гистидина на N-конце, однако данный белок не удалось экспрессировать в бактериальных клетках, поэтому в дальнейшей работе данная конструкция не была использована. Таким образом, методами генной инженерии были созданы вирусные векторы, содержащих ген БО ВМАльт и ген рекомбинантного БО ВМАльт, содержащего в своем составе эпитоп белка VP6 РВ. Данными конструкциями были трансформированы бактериальные клетки. К 200 мл суспензии бактериальных клеток Escherichia coli (штамм XL1-Blue) добавляли 10 мкл лигазной смеси (плазмидной ДНК pQE-60-ER6) и инкубировали во льду в течение 20 минут. После этого выдерживали 90 секунд при 42°С и снова во льду 5 минут. Затем добавляли 800 мкл среды 2xYT (1,6% триптон, 1% дрожжевой экстракта, 0,5% NaCl) и инкубировали при 37°С в течение 50 минут. Высевали суспензию клеток на чашку со средой YT с агаром, содержащей селективный антибиотик ампициллин в концентрации 100 мкг/мл и инкубировали 16 часов при 37°С. Далее трансформированные колонии выращивали в течение ночи в небольшом объеме (3 мл) культуральной среды 2хYT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина при 37°С. Затем из ночной культуры выделяли плазмидную ДНК и использовали ее для трансформации клеток E. coli (штамм SG), которые дают больший выход белка по сравнению с XL1-Blue. К 200 мл суспензии бактериальных клеток добавляли 100 нг плазмиды, далее проводили трансформацию по аналогии с клетками XL1-Blue, за исключением того, что в качестве селективного антибиотика, помимо ампициллина (100 мкг/мл), добавляли канамицин в концентрации 50 мкг/мл. Трансформированные клетки инкубировали при 37°С и постоянном помешивании до оптической плотности ОДλ=600 нм=0,65, добавляли индуктор транскрипции целевого белка изопропил-1-тио-β-D-галактопиранозид (ИПТГ) и снова инкубировали до достижения оптической плотности ОДλ=600 нм=1,60. Электрофоретический анализ бактериального лизата до и после добавления ИПТГ показал активную экспрессию целевого белка после добавления ИПТГ. Молекулярная масса БО ВМАльт составляет 22 кДа, что соответствует данным литературы (Mukhamedzhanova et al., 2011), а молекулярная масса ER6 – 25 кДа, что соответствует расчётной молекулярной массе, полученной с помощью программного обеспечения Vector NTI Advance® 11.0 (Thermo Fisher Scientific, США). Для дальнейшей работы были выбраны конструкции, обеспечивающие максимальную продукцию БО ВМАльт и БО ВМАльт-РВ в клетках E. coli. Затем белки были выделены из бактериального лизата методом метал-хелатной хроматографии на колонке с Ni2+-нитрилоацетатной агарозой. Анализ собранных фракций методом электрофореза полиакриламидном геле показал, что белок после очистки на Ni-НTA агарозе присутствует во фракциях, собранных с колонки, а примеси остальных белков клеток-продуцентов незначительны. Условия экспрессии БО ВМАльт и БО ВМАльт-РВ также были оптимизированы и отработаны таким образом, чтобы получить уровень белка, достаточный для образования ВПЧ уровня продукции белка. Методом электронной микроскопии было подтверждено, что при экспрессии полученных в ходе работы конструкций, в клетках E. coli образуются ВПЧ in situ, после чего они были выделены и очищены с использование метода дифференциального центрифугирования. Таким образом, все цели этапа 2018 года достигнуты, задачи выполнены.
2 26 июня 2019 г.-26 марта 2020 г. Получение вирусоподобных частиц на основе экспрессированного в бактериальных клетках белка оболочки вируса растения и сравнительный анализ их структуры
Результаты этапа: Вирусы растений – перспективные объекты для разработки новых биотехнологий, в том числе для создания прототипов вакцин против патогенов человека и животных. Важно подчеркнуть, что вирусы растений биобезопасны, так как не способны инфицировать клетки млекопитающих. Объектом настоящего исследования является вирус мозаики альтернантеры (ВМАльт), обладающий рядом перспективных свойств для биотехнологии (Donchenko et al., 2018). В ходе выполнения проекта получены искусственные вирусоподобные частицы (ВПЧ) in situ на основе различных рекомбинантных белков оболочки (БО) ВМАльт, экспрессированных в клетках E.coli, в том числе на основе БО ВМАльт, несущего в своем составе эпитоп ротавируса (РВ) А. Проведена их физико-химическая характеристика, а также сравнение со свойствами нативных ВПЧ и вирионов ВМАльт. Получены химерные рибонуклеопротеидные комплексы на основе нативного БО ВМАльт и рекомбинантного БО ВМальт, несущего в своем составе эпитоп РВ А (БО ВМАльт РВ-А), изучены их свойства. Созданы комплексы на основе рекомбинантного БО ВМАЛЬТ РВ-А и структурно модифицированного вируса табачной мозаики. Данные результаты важны как с точки зрения расширения фундаментальных знаний о природе и структуре вирусных и вирусоподобных частиц, так и с точки зрения их практического применения при создании новых прототипов вакцин.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".