ИСТИНА

Цель проекта — исследование координированных изменений топологии мембран фотосинтетического аппарата и запасающих структур в клетках одноклеточных фототрофных эукариот (микроводорослей, МВ) при акклимации к действию стрессоров. Планируется исследовать влияние доступности неорганического азота (нитрата), фосфора (ортофосфата) и углерода (CO2) на микроморфометрические параметры, топологию и липидный состав мембран хлоропластов, цитоплазматических олеосом и вакуолей клеток при культивировании на свету высокой интенсивности. Будет исследована взаимосвязь характерных изменений топологии мембран хлоропластов и параметров фотосинтетической активности клеток микроводорослей в норме и при стрессах, вызванных дефицитом элементов минерального питания и высокими уровнями CO2. Также будут проанализированы характерные изменения топологии мембран олеосом и вакуолей при стресс-индуцированном накоплении и мобилизации запасных липидов. Особое внимание планируется уделить анализу внутриклеточного распределения резервов фосфора при адаптивной реорганизации компартментов клеток микроводорослей при стрессах. В ходе реализация проекта будут получены новые ценные сведения о взаимосвязи структуры и функции клеточных органелл, а также о связи адаптивной перестройки мембран, толерантности к стрессам и эффективности продукционного процесса фотоавтотрофных микроорганизмов.

The aim of the project is to study coordinated changes in the topology of membranes of photosynthetic apparatus and storage structures in the cells of unicellular phototrophic eukaryotes (microalgae, MA) during stress acclimation. We planned to investigate the effect of the availability of inorganic nitrogen (nitrate), phosphorus (orthophosphate) and carbon (CO2) on the micromorphometric parameters, topology and lipid composition of membranes of chloroplasts, cytoplasmic oleosomes and vacuoles of cells in the cultivation of high intensity light. The interrelation of characteristic changes in the topology of chloroplast membranes and parameters of photosynthetic activity of microalgae cells in normal conditions and under stress caused by deficiency of mineral nutrition elements and high levels of CO2 will be studied. Characteristic changes in the topology of oleosome membranes and vacuoles during stress-induced accumulation and mobilization of replacement lipids will also be analyzed. Special attention will be paid to the analysis of the intracellular distribution of the reserves of phosphorous in the adaptive reorganization of the cell compartments of microalgae under stresses. In the course of the project implementation, new valuable data will be obtained on the interrelation of the structure and function of cellular organelles, as well as on the connection of adaptive membrane restructuring, stress tolerance and the efficiency of the production process of photoautotrophic microorganisms.

В ходе реализации проекта планируется: - получить подробную количественную ультраструктурную характеристику топологии мембранного аппарата хлоропластов, а также пластоглобул, олеосом и вакуолей в клетках симбиотических микроводорослей в разных фазах роста культуры в условиях, благоприятных для роста культуры); - исследовать влияние стрессоров - дефицита неорганического азота (нитрата), фосфора (ортофосфата), а также избытка неорганического углерода (CO2) на микроморфометрические параметры, топологию и липидный состав мембран хлоропластов, цитоплазматических олеосом и вакуолей клеток микроводорослей; - исследовать влияние комбинированного стресса, вызванного дефицитом минерального питания и светом высокой интенсивности на перестройки компартментов клеток микроводорослей; - выявить связи между количественными параметрами топологических изменений мембран компартментов и липидным составом клеток микроводорослей при стрессах; - исследовать зависимости между количественными параметрами топологии мембран хлоропластов и функциональной активностью фотосинтетического аппарата в норме и при стрессах, вызванных дефицитом элементов минерального питания и высокими уровнями CO2; - проанализировать характерные изменения топологии мембран олеосом и вакуолей при стресс-индуцированном накоплении и мобилизации запасных липидов; - охарактеризовать внутриклеточное распределение резервов фосфора при адаптивной реорганизации компартментов клеток микроводорослей.

Коллектив имеет многолетний опыт работы с различными группами фототрофных микроорганизмов, включая анализ ультраструктурной модификации МВ и цианобактерий в составе симбиозов с беспозвоночными животными и растениями и в изолированных культурах. Коллектив располагает коллекцией оригинальных изолятов МВ контрастных экологических групп, включая МВ с потенциально высокой способностью к избыточному поглощению P в богатых органикой средах; для ряда МВ установлена таксономическая принадлежность на основе морфологических и ультраструктурных особенностей и анализа нуклеотидных последовательностей генов рибосомальной РНК и гена rbcL. Отдельные изоляты из этой коллекции будут исследованы в рамках предлагаемого проекта. К настоящему времени охарактеризованы рост, динамика жирнокислотного и пигментного состава клеток ряда этих изолятов, получены данные о потенциальной способности симбиотических МВ к индукции синтеза и накоплению липидов в стрессовых условиях, в том числе при избытке органического углерода и фосфора. Предварительными исследованиями установлена высокая CO2-толерантность намеченных к исследованию симбиотических МВ. Авторами проекта разработаны эффективные и чувствительные оптические методы для недеструктивного мониторинга физиологического состояния культур, основанные на спектроскопии поглощения и отражения, а также на измерении переменной флуоресценции хлорофилла в клетках микроводорослей.

В ходе работы проведено комплексное исследование топологических изменений мембранных компартментов клеток МВ в комбинации с исследованием ультраструктурных и биохимических изменений жирнокислотного профиля и классов липидов клеток МВ при варьировании условий освещения, доступности неорганического углерода, азота и фосфора. Основное внимания было сконцентрировано на ассимиляционном аппарате и компартментах, накапливающих органические (углеводы и липиды) и неорганические (фосфор в виде полифосфатов, а также азот) резервные соединения. Проведен сравнительный анализ тенденций изменений размеров хлоропластов и стромы с тилакоидами (СТМ), состояния фотосинтетических мембран и топологических характеристик мембран оболочки хлоропластов. Сделано заключение, что особенностями проявления толерантности к стрессу в фотосинтетической клетке и вероятными общими стрессовыми реакциями клеток зеленых МВ являются контролируемое снижение или, наоборот, расширение фотосинтетического аппарата, безопасная диссипация уже поглощенной световой энергии, поддержание фотосинтеза и сохранение ресурсов углерода, энергии, и минеральных питательных веществ, обеспечивающих быстрое восстановление после стресса. В ходе реализации Проекта для анализа содержимого вакуолей оптимизированы методы подготовки химически фиксированных образцов для обзорной просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и методов аналитической ПЭМ в отношении допустимых контрастирующих агентов (осмий, уран, свинец) и толщины срезов. Показано, что использование крио-протокола подготовки образцов микроводорослей (МВ) для ПЭМ, включающего крио-фиксацию, не дает существенных преимуществ в сохранности морфологии и элементного состава основных резервов фосфора в клетках МВ по сравнению с использованием традиционной химической фиксации клеток. Основные клеточные резервы фосфора представлены в форме обогащенных фосфором включений типа I в клетках различных зеленых МВ, относящихся к контрастным географическим, экологическим и таксономическим группам. Гетерогенность основных резервов азота (включений типа II) в клетках МВ проявляется в различной морфологии и различиях в степени взаимодействия с тетраокисью осмия. И симбиотические, и свободноживущие зеленые МВ способны накапливать кристаллоидные включения типа II с низким сродством к тетраокиси осмия. Способность к накоплению гомогенных включений типа II с высоким сродством к тетраокиси осмия является общей способностью для клеток представителей контрастных групп МВ, различающихся по таксономической принадлежности, географическому происхождению и экологическим признакам.