| 1 |
1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. |
Исследование кинетики рекомбинации зарядов в комплексах фотосистемы 1 из цианобактерий, содержащих производные нафтохинона |
| Результаты этапа: В настоящей работе неинвазивный метод замещения хинонов был применен для сравнения кинетики рекомбинации зарядов и взаимодействия с экзогенным акцептором метилвиологеном препаратов ФС 1, содержащих в сайте связывания А1 хиноны с более положительными потенциалами полувосстановления, чем природный филлохинон -пластохинон и 2,3-дихлоронафтохинон. Показано, что добавление микромолярной концентрации МВ приводит к предотвращению рекомбинации зарядов между Р700+ и (FA/FB)- во фракции РЦ ФС 1, составляющей 30-40%, за счет прямого переноса электронов на экзогенный акцептор МВ. Увеличение концентрации МВ до 1 мМ приводило к дальнейшему увеличению эффективности переноса на МВ (до 50%). Исследование кинетики индуцированного лазерными вспышками восстановления фотоокисленного Р700 на препаратах ФС 1 из MenB, в которых PQ в сайте А1 был замещен на высокопотенциальный 2,3-дихлоро-1,4-нафтохинон показало, что основной вклад (~72%) вносит быстрая компонента с характерным временем ~0.23 мс. Отметим, что эта компонента является, по крайней мере, на порядок более быстрой, чем в случае ФС 1-PQ. Этот результат качественно согласуется с данными по регистрации кинетики спада ∆А, измеренной на длине волны 820 нм в анаэробных условиях на аналогичных образцах (Mula et al., Appl. Magn. Resonance, 2012, 11, p. 946). Существенно более быстрое восстановление Р700+ в этих образцах объясняется тем, что сдвиг редокс-потенциала хинона в более положительную область приводит к смещению равновесия между прямыми и обратными реакциями окисления хинона в сайте А1 в пользу последних. Следовательно, наблюдаемая кинетическая стадия обусловлена рекомбинацией заряда между Cl2NQ- и Р700+. В этом случае восстановительный потенциал хинона Cl2NQ в сайте А1 более положителен не только чем потенциал FХ, но и чем потенциал FA/FB, то есть окисления Cl2NQ- железо-серными кластерами не происходит, а рекомбинация заряда на Р700+ идет только с Cl2NQ- в сайте А1. Ускорение быстрой фазы рекомбинации в препаратах ФС 1- Cl2NQ по сравнению с препаратами ФС 1-PQ обусловлено более положительным потенциалом Cl2NQ, чем PQ в сайте А1. Добавление МВ приводило к незначительному замедлению кинетики восстановления фотоокисленного Р700+. Полученный результат указывает на то, что при замещении PQ в сайте связывания А1 на более высокопотенциальный Cl2NQ, переноса электрона на последующие акцепторы – железо-серные кластеры FX, FA и FB не происходит, а восстановление Р700+ в результате рекомбинации зарядов происходит не с железо-серных кластеров, а с более раннего хинонного акцептора А1. Существенное уменьшение эффекта метилвиологена обусловлено тем, что этот экзогенный акцептор, эффективно окисляющий железо-серные кластеры в ФС 1, по термодинамическим и структурным причинам плохо взаимодействует с Cl2NQ в сайте А1. Полученные данные позволяют выявить особенности переноса электронов на акцепторном участке ФС 1 и открывают возможности независимой оценки редокс-потенциалов хинонов в сайте связывания А1, а также влияния на них белкового окружения.
Известно, что природный вторичный акцептор электрона в ФС 1 – филлохинон – характеризуется рекордно низким для фотосинтетических цепей переноса электрона значением редокс-потенциала – порядка -700 - -800 мВ. Это значение обусловлено необходимостью эффективного восстановления фотосистемой 1 низкопотенциальных акцепторов электронов ферредоксина и НАДФ+. Редокс-потенциал первичного акцептора электрона А0 находится в диапазоне -1200 - -1250 мВ. Таким образом, свободная энергия переноса электрона от А0 на А1 составляет порядка -450 - -500 мВ. Нами была предпринята попытка встроить в сайт А1 ФС 1 производные антрахинонов, характеризующиеся еще более низкими значениями редокс-потенциалов, чем филлохинон (1,5-антрахинон – примерно на 100 мВ и 1,2-антрахинон примерно на 150 мВ). При этом свободная энергия реакции должна была уменьшиться до значений -400 - -300 мВ. Известно, что антрахиноны являются весьма гидрофобными соединениями и их встраивание в сайт А1 путем инкубации ФС 1 в присутствии избытка антрахинона не происходит. Для достижения поставленной задачи мутантный штамм MenB цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803, содержащий в сайте А1 пластохинон, выращивали в среде, содержащей производные антрахинонов. При этом происходило спонтанное встраивание антрахинонов в сайт А1 ФС 1. Из штаммов MenB, выращенных в присутствии производных антрахинонов были выделены и охарактеризованы функционально-активные комплексы ФС 1. В предварительных опытах было продемонстрировано, что кинетика переноса зарядов с первичного акцептора А0 на вторичный акцептор А1 в таких комплексах несколько замедляется. Можно предположить, что эта реакция происходит вблизи плато на кривой теоретической маркусовской зависимости скорости переноса электрона от величины свободной энергии. |
| 2 |
1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. |
Исследование кинетики рекомбинации зарядов в комплексах фотосистемы 1 из цианобактерий, содержащих производные нафтохинона |
| Результаты этапа: 1) Для сравнения и оценки редокс-потенциалов хинонов в сайте А1 комплексов ФС 1, выделенных из клеток цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 дикого типа и мутантного штамма menB с замещенными хинонами, нами было исследовано взаимодействие комплексов ФС 1, содержащих различные хинонные кофакторы в сайте связывания А1, с экзогенными акцептором электронов метивиологеном (МВ). Нами были использованы комплексы, выделенные из цианобактерий дикого типа (содержащих филлохинон (PhQ) в сайте связывания А1) и мутантного штамма menB (содержащих в А1-сайте пластохинон (PQ), который в ряде случаев замещался 2,3-дихлор-1,4-нафтохиноном (Cl2NQ)). Таким образом, нами были изучены три типа комплексов ФС 1: дикого типа; menB, содержащий пластохинон (menB-PQ); menB, содержащий Cl2NQ (menB-Cl2NQ). Нами были получены кинетики восстановления фотоокисленного P700 в зависимости от концентрации экзогенного акцептора электронов МВ для трех исследуемых типов комплексов. На первом этапе кинетики были проанализированы с использованием стандартного мультиэкспоненциального разложения. Во всех типах комплексов были выявлены две основные компоненты: более быстрая, которая соответствовала рекомбинации зарядов, и более медленная, которая отражала восстановление фотоокисленного Р700 от экзогенного донора электронов в той части комплексов, где произошел перенос электрона от терминальных кофакторов ФС 1 к экзогенному акцептору электронов (молекулярный кислород или МВ). Быстрая компонента имела разные характерные времена t в различных типах комплексов. Наиболее медленной она оказалась в комплексах ФС 1 дикого типа (t ~70 мс), где рекомбинация происходила с железо-серных кластеров. Значительно более быстрая кинетика наблюдалась в комплексах menB-PQ (t ~3 мс), где рекомбинация, как было показано ранее, также идет с железо-серных центров, и menB-Cl2NQ (t ~0,15 мс), где рекомбинация происходит с хинонного кофактора А1. Характерное время самой медленной компоненты практически не менялось от образца к образцу и составило ~500 мс. Добавление экзогенного акцептора приводило к изменениям вкладов, но не характерных времен, во всех типах комплексов: с увеличением концентрации акцептора вклад медленной компоненты увеличивался за счет уменьшения вклада более быстрой компоненты. Анализ зависимостей кинетики переноса электрона от концентрации экзогенного акцептора в различных типах комплексов позволил нам построить кинетическую модель реакций переноса электрона в ФС 1. Разработанная модель дала возможность аппроксимировать кинетику восстановления Р700 для всех концентраций МВ При этом кинетические параметры, полученные с помощью модели и с помощью мультиэкспоненциального разложения, оказались очень близки. Модель позволила нам оценить константы равновесия реакций между кофакторами A1 и FX в трех типах комплексов. Константы равновесия были оценены как 5•10^6 с^-1 для дикого типа, 1.4•10^4 с^-1 для menB-PQ и 1.5•10^9 с^-1 для menB-Cl2NQ. Сравнение кинетических параметров, полученных для различных систем позволило оценить среднеточечные потенциалы хинонных кофакторов в А1-сайте в трех типах комплексов. Они составили -680 мВ для PhQ, -590 мВ для PQ и -370 мВ для Cl2NQ.
2) Разработана расширенная молекулярно-динамическая модель фотосистемы 1.
Исследование фотосистемы 1 (ФС 1) с помощью разработанной в 2015 году молекулярно-динамической модели продемонстрировало, что энергетические характеристики реакции переноса электрона во многом определяются тепловыми флуктуациями белкового матрикса на значительном расстоянии от собственно реакционного центра. В частности, в энергию реорганизации реакции переноса электрона существенный вклад вносят флуктуации заряженных аминокислотных групп, расположенных на периферии белкового комплекса.
Для учета данных дальнодействующих сил была построена расширенная молекулярно-динамическая модель ФС 1, включающая 9 белковых цепей (A, B, C, D, E, F, I, J, X), все кофакторы цепи переноса электрона (6 молекул хлорофилла а, 2 молекулы филлохинона PhQ и 3 железо-серных кластера Fe4S4), а также тесно связанные с белком молекулы хлорофилла антенны (84 молекулы), 19 молекул бета-каротина и четыре молекулы химически уникальных липидов (1,2-дипальмитоил-фосфатидил-глицерол и 1,2-дистеароил-моногалактозил-диглицерид). Система была погружена в бислойную липидную мембрану, состоящую из 213 молекул липида (1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина), и окружена водой (более 25000 молекул) до заполнения прямоугольной ячейки. Моделируемая система включала более 150000 атомов, из которых около 44000 атомов приходилось на собственно белковый комплекс.
Подготовка системы включала в себя несколько этапов постепенной релаксации системы, а именно: минимизацию энергии водной части системы, релаксационную динамику липидной мембраны при наложенных гармонических ограничениях на положения тяжелых атомов белкового комплекса (50 нс), и, на конечном этапе, общую релаксацию моделируемой системы длительностью 100 нс.
После уравновешивания моделируемой системы были проведены точечные модификации аминокислотных остатков в окрестности реакционного центра ФС 1, а также исследовано влияние нескольких более общих структурных изменений комплекса. Изучались структурные изменения при следующих точечных мутациях в окрестностях кофакторов цепи переноса электрона: замены метионина, лигандирующего хлорофилл Хл3 в ветвях А и В, на аспарагин, замены аспарагина, координирующего молекулу воды-лиганд хлорофилла Хл2 в ветвях А и В, на лейцин и гистидин, а также структура комплекса ФС 1 при удалении белковых субъединиц C, D и E, приводящем к потере терминальных железо-серных кластеров FA/FB. С полученными модифицированными комплексами была проведена дополнительная релаксация системы.
Для определения перспективных мутаций, способных повлиять на характеристики реакций переноса электрона в области терминальных железо-серных кластеров, был проведен анализ подвижности белкового матрикса ФС 1 в окрестности кофакторов цепи переноса электрона А1 и Fx. Полученные результаты позволяют выделить в качестве перспективных мишеней остатки триптофана Trp673B и симметричного ему глицина Gly693A, расположенные между хинонами А1 ветвей А и В. Ароматическое кольцо триптофана структурно соединяет две центральных белковых субъединицы комплекса А и В, при этом разделяя большую полость, заполненную молекулами воды, на два асимметричных кластера. Данные молекулярной динамики системы показывают, что асимметричное структурированное расположение молекул воды в этих лакунах является одной из основных причин различных значений окислительно-восстановительного потенциала молекул филлохинона в ветвях А и В (вторичные акцепторы А1А и А1В). Существенное изменение геометрии любого из этих остатков в результате мутации может привести к перестройке системы водных взаимодействий в этих кластерах и, соответственно, к изменению редокс-характеристик хинонов А1.
На основе данных молекулярно-динамического симулирования системы на протяжении 15 нс была рассчитана динамика электрического потенциала на основных кофакторах ФС 1. Спектральный анализ данного потенциала (преобразование Фурье) позволяет выделить основные осцилляционные моды движений системы, оказывающие влияние на процесс переноса электрона. Проведенный анализ показал наличие нескольких ярко выраженных пиков, соответствующих основным вибрационным модам ФС 1. Были изучены усредненные спектры белковой, водной и лигандной частей системы, найденные моды были отнесены к различным компонентам комплекса, а именно: для белковой части характерны колебания на частотах около 700, 1260 и 3730 см^-1, для воды - широкий спектр колебаний медленнее 830 см^-1, а для лигандов - узкий пик в районе 800 см^-1.
|
| 3 |
1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. |
Исследование кинетики рекомбинации зарядов в комплексах фотосистемы 1 из цианобактерий, содержащих производные нафтохинона |
| Результаты этапа: 1. С помощью прямого электрометрического метода на протеолипосомах, содержащих комплексы ФС 1 из мутантного штамма menB цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803, изучены электрогенные реакции, обусловленные переносом электрона между молекулами пластохинона (PQ) в сайте А1 и железо-серными центрами FX, FA и FB.
Ранее аналогичная электрогенная реакция была качественно продемонстрирована нами на комплексах ФС 1 из дикого типа цианобактерий Synechocystis sp. PCC 6803, содержащих в сайте связывания А1 низкопотенциальный филлохинон (PhQ) (Mamedov et al., FEBS Letters, 1998, 431, 219-223). Кинетика переноса электрона от филлохинона в сайте А1 на железо-серные кластеры имеет характерные времена в диапазоне 15 – 200 нс. Вследствие малой амплитуды электрогенного сигнала и слишком быстрой кинетики переноса электрона на этом участке ЭТЦ (характерное время ~200 нс находится на пределе временного разрешения электрометрической установки) количественный анализ кинетических компонент не был возможен. Однако при замещении нативного PhQ на PQ в сайте А1 (в мутантном штамме menB) происходит существенное замедление кинетики переноса электрона на железо-серные кластеры от субмикросекундных до субмиллисекундных характерных времен (Semenov et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 23429-23438). В этом случае кинетика реакций оказывается во временном диапазоне надежно регистрирующемся с помощью прямого электрометрического метода. Кроме того известно, что при ассоциации протеолипосом с плоской искусственной коллодиевой фосфолипидной мембраной (ИЛМ) происходит частичное вымывание непрочно-связанных гидрофобных редокс-кофакторов в раствор фосфолипидов в растворителе н-декане, использующемся для приготовления искусственной мембраны. Поскольку PQ в сайте А1 связан с белком существенно менее прочно, чем PHQ, то значительная часть молекул PQ вымывается из сайта А1, и переноса за пределы А1 не происходит, и электрон рекомбинирует на фотоокисленный первичный донор Р700 с предыдущего акцептора А0 за несколько десятков наносекунд. В результате амплитуда фотоэлектрического ответа существенно снижается. Для преодоления этой проблемы в среду инкубации нами был добавлено производное PQ – децил-PQ, которое имеет значительно меньшую гидрофобность, чем PQ, но способно замещать природный PQ и эффективно выполнять его функцию как редокс-переносчика в сайте А1 ФС 1.
Как показали эксперименты с протеолипосомами, содержащими ФС 1 из мутантного штамма menB, при добавлении децил-PQ в экспериментальную ячейку амплитуда фотоэлектрического ответа существенно возрастала за счет встраивания децил-PQ в сайт А1. При этом наблюдалось пропорциональное увеличение амплитуды сверхбыстрой компоненты электрогенеза, обусловленной переносом электрона от Р700 на А1 (которая имеет характерное время 25 пс и не может быть разрешена при использовании прямого электрометрического метода), так и более медленной компоненты, обусловленной переносом электрона от А1 на железо-серные кластеры. Показано, что относительный вклад электрогенных реакций на этом участке электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) составляет ~40% от суммарного электрогенеза в ФС 1. Кинетика электрогенных стадий аппроксимировалась двумя экспоненциальными компонентами с характерными временами 10 мкс и 80 мкс и относительными амплитудами ~ 65 и 35%, соответственно. Можно предположить, что более быстрая компонента обусловлена переносом электрона по ветви редокс-кофакторов В, а более медленная – переносом по ветви А. Отметим, что в ФС 1 из цианобактерий дикого типа, содержащих PhQ, перенос электрона является асимметричным в пользу ветви А в соотношении 4:1. В то же время, как показывают проведенные эксперименты в ФС 1 из штамма menB, содержащего PQ, кинетика окисления А1- замедляется примерно в 1000 раз, а перенос электрона по симметричным ветвям редокс-кофакторов меняется в пользу ветви В в соотношении 2:1. Причины изменения асимметрии переноса электрона в ФС 1 из menB в настоящее время не вполне понятны, однако можно предположить, что вследствие повышения редокс-потенциалов хинонов в сайтах А1А и А1В при замене PhQ на PQ на 100 мВ перенос электронов по ветви А становится термодинамически невыгодным, в то время, как перенос электрона по ветви В все еще термодинамически выгоден. Однако этот вопрос требует более детального анализа.
2. С помощью абсорбционной и ЭПР-спектроскопии исследовано влияние высушивания в трегалозной стекловидной матрице на кинетику прямого и обратного переноса электронов в комплексах ФС 1 цианобактерий с помощью импульсной абсорбционной и ЭПР-спектроскопии во временном диапазоне от 100 фс до 1 мс.
Лазерная фемтосекундная спектроскопия показала, что при высушивании ФС 1 в трегалозной матрице при относительной влажности 11% кинетика и спектр первичного разделения зарядов между первичным донором электрона Р700 и первичным хлорофильным акцептором А0 (P700+ --> А0-) не меняются по сравнению с таковыми в водном растворе в присутствии детергента (образование первичной ион-радикальной пары происходит за время <100 фс). В то же время, хотя кинетика образования вторичной ион-радикальной пары (P700+ --> А1-) также не изменяется (характерное время t ~25 пс), но эта реакция происходит только в 80% комплексов ФС 1. В оставшейся фракции ФС 1 наблюдается обратный перенос электрона с предыдущего акцептора А0- на фотокисленный Р700+ (А0- --> P700+).
Кинетика обратных реакций в комплексах ФС 1, высушенных в трегалозной матрице, была измерена с помощью импульсной высокочастотной ЭПР-спектроскопии, а кинетика прямого переноса электрона от восстановленных хинонных акцепторов А1А- и А1В- на железо-серные центры [Fe4S4] - путем регистрации абсорбционных изменений на длине волны 480 нм. Было показано, что характерное время переноса электрона от А1А- и А1В- на [Fe4S4] кластеры замедляется с 220 нс (А1А- --> FX) и 20 нс (А1В- --> FX) в растворе до 15 мкс и 80 нс в стекловидной матрице, соответственно. Однако данные импульсной ЭПР-спектроскопии показали, что компонента с t ~15 мкс отражает не только замедлившийся прямой перенос электрона по ветви А (А1А- --> FX), но и обратный перенос по ветви В (А1В- --> Р700+).
Таким образом, показано, что в ФС 1 при высушивании в трегалозной матрице кинетика первичных реакций переноса электрона от Р700 на хлорофильный акцептор А0 и далее на хинонный акцептор А1 не меняется. Однако дальнейшие стадии прямого переноса за пределы хинонных акцепторов А1А и А1В в симметричных ветвях редокс-кофакторов замедляются или предотвращаются вследствие ограничения подвижности белкового комплекса в высушенной трегалозной матрице.
|
