РЕГУЛЯЦИЯ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНОЙ L-АСПАРАГИНАЗЫ ERWINIA CAROTOVORA С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СО-ПОЛИМЕРОВ ПЭГ-ХИТОЗАНАНИР

Соисполнители НИР

ИБМХ РАМН им. В.Н. Ореховича Соисполнитель

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. РЕГУЛЯЦИЯ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНОЙ L-АСПАРАГИНАЗЫ ERWINIA CAROTOVORA С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СО-ПОЛИМЕРОВ ПЭГ-ХИТОЗАНА
Результаты этапа: 1) С целью наработки биомассы для выделения рекомбинантной L- аспарагиназы Erwinia carotovora штамм-продуцент E.coli ВL21(DE3)/pACYC_LANS(КМ) (Патент РФ №244191) выращивали на среде LB с канамицином. Выделено 62 000 МЕ активности фермента (EwA) с удельной активностью 350 МЕ/мг белка, что составляет порядка 200мг фермента. Чистоту ферментного препарата определяли методом электрофореза в 12,5%-ном ДСН-ПААГ. Степень чистоты препарата была оценена как 95-98%. Таким образом, заявленная цель достигнута. 2)Синтезирован ряд со-полимеров хитозана «щеточной» структуры, отличающихся составом и ММ (от 3 до 15 кДа). Для модификации полимеров использовалось активированное производное ПЭГ ММ 5 кДа (mPEGsucNHS–ПЭГ-N- гидроксисукцинимидил сукцинат). Очистка со-полимеров проводилась методом ВЭЖХ. Степень очистки контролировали методом УФ-спектроскопии. Состав со-полимеров устанавливали методом ИК-НПВО спектроскопии. Найдено, что количество цепей ПЭГ связанных с одной цепью хитозана в синтезированных образцах варьируется в пределах от 2 до 40 цепей ПЭГ на цепь хитозана в зависимости от исходного избытка активированного ПЭГ в системе. Общее количество синтезированных и охарактеризованных сополимеров различающихся ММ и составом - более 100 образцов. Этого достаточно чтобы выявить влияние ММ и степени ПЭГилирования хитозана на биокаталитические свойства конъюгатов аспарагиназы с сополимерами. 3) С каждым из синтезированных образцов ПЭГ-хитозана, были получены конъюгаты с EwA различной молекулярной архитектуры: «коронообразной» – где содержится несколько цепей ПЭГ-хитозана связанных одноточечно с аминогруппами фермента и «многоточечной», в которой реализуется многоточечное ковалентное взаимодействие карбоксильных групп фермента с аминогруппами хитозана с образованием амидных связей в присутствие реагента Вудворда. Все конъюгаты были очищены с помощью метода ВЭЖХ. Чистоту препаратов контролировали методом ИК-НПВО и УФ спектроскопии. Всего синтезировано более 100 образцов конъюгатов различного состава и молекулярной архитектуры, которые использовались для оптимизации свойств фермента в плане их удельной активности, стабильности и цитостатической активности в отношении клеточных культур. Каждый конъюгат охарактеризован по составу и структуре методом ИК и КД спектроскопии. Установлено, что вторичная структура белковой глобулы не изменяется при модификации для всех изученных конъюгатов. 4) Разработан новый метод определения аспарагиназной активности с применением КД-спектроскопии. В отличие от классических методов определения аспарагиназной активности (по Несслеру), данный метод является безреагентным, одностадийным, и не требующим специальной пробоподготовки. Все это в несколько раз уменьшает время подготовки и проведения анализа, и позволяет производить анализ модифицированных форм аспарагиназы любого состава. В качестве комлементарного метода определения аспарагиназной активности разработан метод основанный на кондуктометрии. Данный метод также является безреагентным и одностадийным, что значительно уменьшает время проведения анализа. Использование кондуктометрии для наблюдения за ходом реакции позволяет производить определение аспарагиназной активности в средах с высокой оптической плотностью, в которых затруднено или вовсе невозможно применение спектральных методов. 5) С применением методов КД-спектроскопии и кондуктометрии (в зависимости от исследуемых образцов)определены удельные активности всех конъюгатов. При этом установлено, что наибольшей каталитической активностью обладают конъюгаты «коронообразной» молекулярной архитектуры по сравнению с конъюгатами «многоточечной архитектуры». Для лучших образцов достигнуто превышение активности в 4–6 раз по сравнению с нативным ферментом. Исследована глутаминазная активность ряда синтезированных препаратов. Установлено, что образование конъюгатов приводит к снижению каталитической эффективности фермента в отношении глутамина (неспецифическая реакция аспарагиназы, обуславливающая побочные эффекты). А именно, наблюдается увеличение Кm фермента в отношении глутамина в 3 – 3,5 раза и снижению Vmax в 4 – 5 раз по сравнению с нативным ферментом, что соответствует снижению вероятности проявления побочных эффектов при применении аспарагиназных препаратов. Исследовано влияние конъюгирования на стабильность фермента к термоинактивации. Установлено, что конъюгирование увеличивает стабильность препарата при 45С, снижая константу инактивации фермента в 1,5 – 2 раза. Установлено, что в то время как нативный фермент при инкубировании в течении 48 часов в условиях имитирующих физиологические теряет порядка 40% исходной активности, конъюгированный фермент теряет менее 20% активности. 6) Исследована активность ряда синтезированных конъюгатов в отношении лейкозных клеток К562 и клеток аденокарциномы молочной железы MCF7, а также клеток лимфомы Беркитта Raji, и клеток Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза человека Jurkat. В ходе экспериментов было установлено, что максимальная антипролиферативная активность аспарагиназы Erw. carotovora (EwA) проявляется на клеточных линиях лимфомы Беркитта Raji. При этом на данных клетках не наблюдается достоверных различий в процентах выживших клеток с препаратами аспарагиназы: конъюгатами EwA с ПЭГ-хитозанами различного состава, нативной эрвиназой (EwA) и аспарагиназой Medac. При этом следует отметить, что фермент в конъюгате значительно более устойчив при хранении; более устойчив к трипсинолизу, а главное, удельная активность фермента в конъюгатах в 4-6 раз выше, т.е. при той же дозе (в МЕ) в препарате содержится в 4-6 раз (в зависимости от вида конъюгата) меньше белка чем в случае нативных ферментов. Для ряда других изученных клеток установлено, что конъюгирование оказывает положительное влияние на цитотстатическую активность фермента. Так найдено, что в то время как нативный фермент EwA снижает рост лейкозных клеток К562 и клеток аденокарциномы MCF7 на 20% и 30% соответственно, конъюгат EwA с ПЭГ-хитозаном (ММ 3 кДа) подавляет рост клеток на 50 и 60%, соотвественно. Цитостатическая активность конъюгата в отношении данных клеток сравнима с коммерческим препаратом L-аспарагиназы из Е. coli («Medac» Германия).
2 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. РЕГУЛЯЦИЯ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНОЙ L-АСПАРАГИНАЗЫ Rhodospirillum rubrum
Результаты этапа: В 2015 г в рамках проекта проведены исследования направленные на дальнейшее развитие разработанного в 2014г подхода хитоПЭГилирования, который основан на образовании ковалентных конъюгатов фермента с разветвленными сополимерами хитозана (хитоПЭГилирование), для создания L-аспарагиназных препаратов медицинского назначения с улучшенными биокаталитическими характеристиками. 1) Проведена оптимизация молекулярной архитектуры и состава конъюгатов рекомбинантного препарата L-аспарагиназы из Erwinia carotovora (EwA) c ПЭГ-хитозанами с целью повышения каталитической активности фермента в физиологических условиях, субстратной специфичности препаратов (соотношение L-аспарагиназной и L-глутаминазной активностей), стабильности фермента в различных условиях, а также противоопухолевой активности в системах in vitro. a) Для получения препаратов EwA, обладающих оптимальными биофармацевтическими свойствами, было исследовано влияние состава конъюгатов на каталитическую активность фермента, а также влияние образования фермент-полиэлектролитных комплексов на активность фермента. Синтез конъюгатов с производными хитозана различного состава, осуществляли по реакции восстановительного аминирования между свободными аминогруппами фермента и восстанавливающим концом молекул хитозана. В рамках проекта был синтезирован и исследован ряд конъюгатов аспсрагиназы с со-полимерами хитозана различного состава, а также с гликоль-хитозаном (ММ 72 кДа). Молекулярную масса использованных хитозанов варьировали в пределах от 3 до 160 кДа, а содержание цепей ПЭГ от 1 до 40 цепей ПЭГ на одну цепь хитозана. Анализ состава полученных конъюгатов проводился в несколько этапов: разделение методом ВЭЖХ в режиме гель-фильтрации; анализ состава фракций методом ИК-спектроскопии и определение каталитической активности синтезированных конъюгатов [1-9]. Обнаружено, что удельные активности конъюгатов зависят от ММ хитозана, от типа связывания полимера с ферментом (ковалентно-нековалентно) и от наличия и природы заместителя. Так, конъюгаты с ПЭГ-хитозаном (ММ 5 и 15 кДа) характеризуются более высокой каталитической активностью (в 2-5 раз в зависимости от состава полимера) по сравнению с нативным ферментом, в то время как конъюгат с гликоль-хитозаном (М 72 кДа) обладает активностью в 1.3 раза меньшей, чем нативный фермент; конъюгаты аспарагиназы с хитозаном ММ 130-160 кДа характеризуются в 2-3 раза меньшей каталитической активностью. Данный эффект может быть связан с ростом величины Км, вызванным затруднением доступа субстрата к активному центру длинными цепями высокомолекулярного хитозана. Вопрос влияния образования конъюгатов аспарагиназы с ПЭГ-хитозаном на Км рассмотрен подробно ниже. Найдено, что наиболее яркий эффект на каталитическую активность фермента оказывает степень ПЭГилирования хитозана: активность конъюгатов EwA-ПЭГ-хитозан имеет зависимость с оптимумом, который достигается при степени ПЭГилировани хитозана, n(PEG)/n(chit) = 10 – 20 (при ММ хитозана 15 кДа). При этом активность оптимальных по составу конъюгатов более в 4 раза превышает активность нативного фермента [1-5, 7]. Б) рН зависимость активности L-аспарагиназы в составе конъюгатов. Для выяснения молекулярных причин изменения активности конъюгатов по сравнению с нативным ферментом были определены профили рН-зависимости активности конъюгатов аспарагиназы с ПЭГ-хитозанами различного состава. Обнаружено, что образование конъюгатов EwA с ПЭГ-хитозаном приводит к сдвигу рН оптимума в сторону более низких значений рН: рН-оптимум нативной L-аспарагиназы находится в области 8-8,5. Связывание с ПЭГ-хитозанами приводит к смещению рН-оптимума в область физиологических значений рН 6,5 – 7,5 в зависимости от состава конъюгата. Важно отметить, что хитопэгилированные L-аспарагиназы на основе хитозана с ММ 3-15 кДа во всем диапазоне рН превосходят по активности нативный фермент. При этом связывание L-аспарагиназы с высокомолекулярными хитозанами (ММ 70-160кДа) расширяет рН-оптимум фермента, но снижает его активность во всем диапазоне рН. Величина сдвига рН-оптимума зависит от количества свободных аминогрупп в составе хитозана (т.е. уменьшается при увеличении степени ПЭГилирования хитозана). Таким образом, показано, что одной из основной причин повышения активности конъюгатов по сравнению с нативным ферментом является смещение рН-оптимума активности фермента в область физиологических значений рН. В) Влияние молекулярной архитектуры и состава конъюгатов L-аспарагиназы на КM. L-аспарагиназа, как лекарственный препарат, действует в физиологических условиях, в области относительно низких концентраций субстрата. Поэтому важно знать как модификация фермента разветвленным полимером на его способность к связыванию субстрата (параметр КM, который является количественным критерием данного процесса). Для определения кинетических параметров L-аспарагиназы при относительно низких концентрациях субстрата (в области определения КM) в проекте был разработан и применен методы кондуктометрии и рН-статирования [5]. Использование метода рН-статирования позволило определить кинетические параметры Vmax и КM, для конъюгатов аспарагиназы и полиэлектролитных комплексов EwA с ПЭГ-хитозанами в диапазоне ММ хитозанами от 3 до 160 кДа и степеней пэгилирования от 2 до 20 цепей на цепь хитозана. Найдено, что величина КM для всех исследованных конъюгатов и полиэлектролитных комплексов аспарагиназы с ПЭГ-хитозаном (при модификации фермента как высокомолекулярными, так и разветвленными полимерами) KM L-аспарагиназы практически не изменяется. Это означает, что применение конъюгатов EwA с ПЭГ-хитозаном будет эффективным в физиологических условиях - при низком содержании L-аспарагина, что обуславливает возможность их терапевтического применения. Таким образом, результатом оптимизации молекулярной архитектуры и состава конъюгатов является увеличение каталитической эффективности фермента (kcat/KМ) в отношении L-аспарагина при физиологических условиях в 4–6 раз. Г) Исследование ХитоПЭГилирования на субстратную специфичность препаратов L-аспарагиназы (соотношение L-аспарагиназной и L-глутаминазной активностей). L-глутаминазная активность является важнейшей характеристикой L-аспарагиназных препаратов, влияющей на токсичность препарата для человеческого организма и опухолевых клеток. При длительном терапевтическое применение препаратов L-аспарагиназы именно L-глутаминазная активность фермента обуславливает развитие ряда опасных побочных реакций (гепатотоксичность, нефротоксичность, тромбозы, осложнения со стороны ЦНС и др.). Поэтому необходимо исследовать, как хитопэгилирование влияет на L-глутаминазную активность L-аспарагиназы. L-глутаминазная активность препаратов EwA и ее конъюгатов с ПЭГ-хитозаном с применением метод КД спектроскопии, разработанного в проекте [5]. Найдено, что удельная активность по L-глутамину для конъюгата EwA-ПЭГ-хит (ММ хитозана - 3 кДа, n(PEG)/n(chit) = 3,2) составляет 4,2% от активности по L-аспарагину, а для нативной EwA - 7,7%. При этом абсолютные значения активностей по L-глутамину для EwA-ПЭГ-хит и EwA практически совпадают. Это означает, что конъюгирование повышает субстратную специфичность – повышает активность по L-аспарагину, но практически не влияет на каталитические свойства L-аспарагиназы в отношении L-глутамина. Поскольку удельная L-аспарагиназная активность фермента при хитопэгилировании увеличивается в 4 – 6 раз, то при использовании одной и той же действующей дозы нативного фермента и хитопэгилированного препарата можно ожидать, что применение последнего будет сопровождаться менее интенсивными побочными эффектами, обусловленными L-глутаминазной активностью. Д) Исследована термостабильность конъюгатов аспарагиназы с производными ПЭГ-хитозана в зависимости от состава сополимеров. Показано, что связывание фермента с ПЭГ-хитозаном и гликоль-хитозаном значительно увеличивает его устойчивость к термоинактивации, снижая его константу термоинактивации при температуре 45С в 2-3 раза в зависимости от состава сополимера. Это качество делает конъюгаты аспарагиназы с производными хитозана перспективной основой для создания стабилизированного ферментного препарата. Е) В проекте исследовано влияние молекулярной архитектуры и состава конъюгатов на стабильность L-аспарагиназных препаратов к протеолитической деградации. Протеолитическая деградация L-аспарагиназных препаратов под действием содержащихся в крови трипсиноподобных протеаз является одним из важных факторов снижающих время жизни фермента в кровотоке. В проекте было исследовано влияние молекулярной архитектуры конъюгатов на стабильность L-аспарагиназы к протеолитической деградации. Исследована стабильность к протеолизу следующих конъюгатов EwA-ПЭГ-хитозан (3 кДа, n(PEG)/n(chit) = 2,1) и EwA-гликоль-хитозан (72 кДа). Показано, что связывание фермента с ПЭГ-хитозаном и гликоль-хитозаном существенно увеличивает его устойчивость к трипсинолизу (снижая константу инактивации фермента в 1.5-3 раза). Найдено, что увеличение стабильности фермента при использовании высокомолекулярного, но неразветвленного гликоль-хитозана и низкомолекулярного, но разветвленного ПЭГ-хитозана примерно одинаково. В качестве сравнения исследованы препараты пэгилированной L-аспарагиназы ПЭГ-EwA. Найдено, что константы инактивации конъюгатов EwA-ПЭГ-хитозан и препаратов ПЭГ-EwA (без хитозана) в присутствие трипсиноподобных протеаз практически совпадают. Однако, удельная L-аспарагиназная активность EwA-ПЭГ-хитозан значительно выше, чем у нативного фермента и у ПЭГ-EwA. Это означает, что хитопэгилирование является хорошей альтернативой традиционному методу модификации L-аспарагиназ - пэгилированию, потому что хитопэгилирование позволяет получать модифицированные L-аспарагиназные препараты столь же устойчивые к трипсинолизу, как пэгилированные препараты, но существенно более активные. Ж) Оптимизация молекулярной архитектуры и состава конъюгатов EwA c ПЭГ-хитозанами с целью повышения противоопухолевой активности. Для определения связи между цитостатическим действием удельной активностью конъюгатов EwA и различных производных хитозанов исследовали их влияние на несколько видов раковых клеток: хронического миелоидного лейкоза (линия К562) и аденокарциномы молочной железы (линия MCF7), а также лимфомы Беркитта (линия Raji) и острого Т-клеточного лейкоза (линия Jurkat). Использованные в работе лейкозные клетки, относящиеся к линиям К562 и Jurkat отличаются не до конца сниженной активностью L-аспарагинсинтетазы [1, 5, 10], и потому должны быть весьма устойчивы к препаратам на её основе. Клетки линий MCF7 и Raji отличаются сниженной L-аспарагинсинтетазной активностью по сравнению с использованными лейкозными клетками, что делает их более восприимчивыми к действию L-аспарагиназ. Важно отметить, что аденокарцинома молочной железы это солидная опухоль. Изучение влияния L-аспарагиназ на клетки солидных опухолей важно не только с точки зрения понимания молекулярных аспектов цитотстатического действия L-аспарагиназ, но и с точки зрения возможного применения L-аспарагиназ для терапии солидных опухолей. В рамках проекта в 2015г была проведена оптимизация молекулярной архитектуры и состава конъюгатов EwA с ПЭГ-хитозанами. Исследована активность конъюгатов L-аспарагиназы в зависимости от ММ хитозана и степени его пэгилирования: ММ хитозанов варьировали в пределах 3 – 160 кДа; степень пэгилирования хитозана варьировали в пределах 0 – 40 цепей ПЭГ на цепь хитозана. Полученные в проекте данные показывают, что нативный фермент практически не активен в отношении К562. Конъюгат EwA с хитозаном (3 кДа) демонстрирует незначительную цитостатическую активность. В то же время, конъюгат EwA с ПЭГилированным хитозаном (3 кДа) демонстрирует существенную цитостатическую активность. Доза препарата в 5 МЕ/мл снижает рост клеток до 40% от контрольного. Это является хорошим результатом для препарата применяемого в составе комплексной терапии с другими цитостатиками: азасерином, винкристином, метотрексатом. Иная картина наблюдалась в отношении опухолевых клеток острого лимфобластного лейкоза Jurkat. Нативный фермент активен в отношении клеток Jurkat снижая рост клеток до 80 – 70% по сравнению с контролем. Конъюгаты EwA-ПЭГ-хит (ММ 3 кДа) и EwA-ПЭГ-хит (ММ 5 кДа) демонстрирует более высокую цитостатическую активность: наблюдается максимальное снижение роста клеток до 50 и 60 % от контроля, соответственно. Конъюгат EwA-гликоль-хитозан практически не активен, что свидетельствует о критическом влиянии молекулярной архитектуры L-аспарагиназного препарата на его активность в отношении клеток обладающих механизмами резистентности к действию L-аспарагиназ. Влияние хитопэгилирования на активность L-аспарагиназ в отношении клеток не лейкозного происхождения были исследовано с использованием клеток лимфомы Беркитта (Raji). Найдено, что как нативный фермент, так и исследованные конъюгаты значительно замедляют рост опухолевых клеток Raji. При этом для всех препаратов, наблюдается выраженная дозовая зависимость. Максимальное снижение роста клеток Raji достигает 50 – 55% как для нативного фермента, так и конъюгатов с ПЭГ-хитозанами и гликоль-хитозаном. Это означает, что в случае клеток с повышенной чувствительностью к L-аспарагиназам структура конъюгата его архитектура не является решающим фактором, определяющим его цитостатическую активность. В то же время, в случае клеток резистентных к L-аспарагиназам строение конъюгата ключевым образом влияет на его цитостатическую активность. Показано, что решающим фактором, влияющим на активность конъюгатов EwA является его степень пэгилирования хитозана. Наибольшей цитостатической активностью в отношении всех исследованных опухолевых клеток обладают конъюгаты с ПЭГилированными хитозанами с ММ 3-5 кДа. Необходимо отметить, что удельная активность фермента в конъюгатах в 3-5 раз выше, т.е. при той же дозе (в МЕ) в препарате содержится в 3-5 раз меньше белка, чем в случае нативного фермента, что может позволить значительно снизить иммуногенность препарата при создании новых лекарственных форм. Сами хитозаны и ПЭГ-хитозаны практически не оказывают влияния на рост исследованных клеток, как было продемонстрировано в контрольном эксперименте в отсутствие фермента. Это означает, что цитостатическая активность конъюгатов EwA связана именно с каталитической активностью L-аспарагиназы. Таким образом, результаты, полученные при изучении противоопухолевой активности конъюгатов L-аспарагиназы Erwinia carotovora, свидетельствуют, что хитопэгилирование является перспективным подходом, позволяющим улучшить биофармацевтические свойства L-аспарагиназы и расширить спектр действия фермента. 2) Исследование влияния ХитоПЭГилирования на иммуногенность ферментного препарата Одним из наиболее серьёзных факторов, ограничивающих возможности L-аспарагиназной терапии, является развитие аллергических реакций различной степени тяжести вплоть до анафилактического шока. Наиболее эффективными способами снизить иммуногенность L-аспарагиназных препаратов являются снижение дозы фермента и его модификация различными полимерами. Продемонстрировано, что предлагаемый в настоящем проекте метод хитопэгилирования позволяет увеличить удельную L-аспарагиназную активность фермента в 4 – 6 раз, по сравнению с нативным ферментом, соответственно снижая необходимую (по массе белка) дозу препарата. Для определения влияния состава конъюгатов L-аспарагиназы с ПЭГ-хитозаном на иммуногенность ферментного препарата был проведен сравнительный анализ иммуногенности препаратов исходной и хитопэгилированных L-аспарагиназ (ПЭГ-хитозан, ММ 3 – 15 кДа, степень пэгилирования 2 – 20 цепей ПЭГ на цепь хитозана). В качестве контроля использовали нативную EwA, а также коммерческие препараты пэгилированной и нативной L-аспарагиназы E. сoli (Medac). Для анализа иммуногенности хитопэгилированного препарата был избран метод твердофазного ИФА, как метод, обладающий наилучшими метрологическими характеристиками [1, 4, 11]. С помощью прямого твердофазного ИФА определяли титр антител в сыворотках, полученных в результате иммунизации мышей нативной и хитопегилированной аспарагиназой. При этом было установлено, что иммуногенность препарата при хитопэгилировании снижается в 3 – 6 раз в зависимости от состава препарата. Иммуногенность хитопэгилрованных препаратов снижена, по сравнению с нативной L-аспарагиназы E. coli и находится на уровне коммерчески доступной пэгилированной L-аспарагиназы Medac [1, 4, 11]. Таким образом, хитопэгилирование позволяет добиться значительного снижения иммуногенности L-аспарагиназы Erwinia carotovora за счет снижения иммуногенности при модификации белка разветвленным сополимером, ПЭГ-хитозаном, а также за счет уменьшения терапевтической дозы препарата. 3) Важным преимуществом применения технологии ХитоПЭГилирования по сравнению с традиционным ПЭГилированием является возможность целенаправленно изменять локальную ионную силу и значение рН вблизи активного центра фермента [2-3, 12-13]. В связи с этим, метод хитоПЭГилирования представляется наиболее перспективным в том случае, когда рН оптимум активности терапевтически значимого фермента существенно отличается от физиологического. Таким ферментом является L-аспарагиназы из Rhodospirillum rubrum (RrA), рН оптимум которого 9.2-9.5 [14-16]. В 2015 г проведена апробация метода ХитоПЭГилирования (разработанного в проекте в 2014 году на примере L-аспарагиназы EwA) с использованием другого рекомбинантного фермента, L-аспарагиназы (RrA), перспективного для разработки нового лекарственного препарата, иммунологически отличного от применяемого в настоящее время в медицинской практике препарата из E. coli (EcA). RrA, как фермент с более высокой специфичностью и, наиболее вероятно, с меньшей иммуногенностью представляет интерес для создания нового лекарственного препарата на его основе. Для оптимизации состава и молекулярной архитектуры конъюгатов RrA в проекте 2015 г были исследованы ряд хитопэгилированных форм фермента, различающихся ММ хитозана и степенью пэгилирования хитозана. При этом было установлено, что наибольшей L-аспарагиназной активностью при физиологических условиях обладают конъюгат фермента с ПЭГ-хитозаном (ММ 3 кДа, n(PEG)/n(chit) = 3 – 4). В то время как удельная активность нативного фермента при физиологических условиях составляет около 50 – 60 МЕ/мг, активность конъюгата с ПЭГ-хитозаном составляет 120 – 140 МЕ/мг в зависимости от состава ПЭГ-хитозана. Таким образом, метод хитопэгилирования увеличивающий каталитическую активность RrA, открывает широкие перспективы для введения данного фермента в терапевтическую практику. Приведенные данные демонстрируют, что эффективность применения хитопэгилирования для улучшения актвиности L-аспарагиназ не зависит от их происхождения. Для выяснения причин наблюдаемого эффекта было исследовано влияние хитопэгилирования на рН-зависимость L-аспарагиназы Rhodospirillum rhubrum. Сравнивали рН-зависимость активности нативного фермента, его конъюгата с хитозаном (ММ 3 кДа) и конъюгата с ПЭГ-хитозаном (ММ 3 кДа, n(PEG)/n(chit) = 3 – 4) в диапазоне значений рН 4 – 11. Установлено, что связывание RrA с хитозаном, приводит к незначительному изменению рН-оптимума фермента. Максимум активности конъюгата находится в области 8 – 8,5, в то время как оптимум нативного фермента находится в области 9,2 – 9,5. При этом хитозан изменяет форму кривой рН-зависимости, делая ее более широкой и «размытой». В случае конъюгата RrA и ПЭГ-хитозана рН-оптимум смещен в область более кислых рН примерно на одну единицу по сравнению с нативным ферментом, и наблюдается в районе значений рН 7,5 – 8,5. Очевидно, что наблюдаемая разница в поведении между конъюгатами фермента с непэгилированным и пэгилированным хитозаном обуславливается наличием в последнем цепей ПЭГ. Поскольку степень пэгилирования хитозана в исследованных конъюгатах не превышает n(PEG)/n(chit) = 3 – 4, поэтому нельзя рассматривать наблюдаемые эффекты исключительно как следствие изменения количества аминогрупп в поликатионе. Скорее всего это связано с тем, что ПЭГ образуя множественные водородные связи изменяет эффективные рКа ионогенных групп на поверхности белковой глобулы. Определение механизма влияние ПЭГ-хитозанов на форму рН-зависимости активности фермента станет предметом дальнейших исследований. Таким образом, продемонстрировано, что метод хитопэгилирования эффективен для повышения каталитической активности в физиологических условиях L-аспарагиназ из различных источников (как Erwinia carotovora так и Rhodospirillum rubrum) за счет сдвига оптимума рН зависимости активности ферментов в сторону физиологических значений рН, а также за счет оптимизации микроокружения фермента при образовании конъюгатов с ПЭГ-хитозаном. 4) В 2015 г проведено исследование молекулярных деталей цитостатического действия L-аспарагиназ. Несмотря на широкий интерес, проявляемый на протяжении многих лет к L-аспарагиназам, детальный механизм противоопухолевого действия L-аспарагиназ до конца не раскрыт [10, 14-16]. Для изучения молекулярного механизма цитотоксического действия аспарагиназ в проекте проведен поиск корреляций между адсорбционной способностью фермента на клетках, его поверхностным зарядом, его стабильности при длительной инкубации в питательной среде и его цитостатической активностью по отношению к клеткам различного типа. В исследованиях противоопухолевой активности конъюгатов L-аспарагиназы, (проведенных нами в 2014г в рамках данного проекта) было установлено, что наиболее активным конъюгатом в отношении исследованных опухолевых клеток является EwA-ПЭГ-хитозан (ММ 3 кДа). Так в опытах in vitro показано, что конъюгаты EwA с ПЭГ-хитозаном проявляют более высокую противоопухолевую активность (на 20-40%) по сравнению с нативным ферментом в отношении клеток хронического миелоидного лейкоза человека К562, клеток аденокарциномы молочной железы MCF7, несмотря на то, что действующая доза препаратов (в единицах активности) одинакова. Кроме того из литературных данных известно, что одинаковые дозы (в единицах активности) различных препаратов L-аспарагиназы (из различных источников, а также модифицированных и мутантных форм) оказывают различное цитостатическое действие на клетки, чувствительные к L-аспарагиназам. Удовлетворительное объяснение данного факта в литературе не встречается. Для того чтобы объяснить различие в противоопухолевой активности нативной и хитопэгилированной L-аспарагиназ нами была исследована связь между такими параметрами как стабильность конъюгата и нативного фермента в питательной среде, связывание с белками питательной среды, поверхностный заряд фермента и его противоопухолевая активность. Определены дзета-потенциалы исследуемых конъюгатов аспарагиназы. Обнаружено, что конъюгаты, для которых изучалась цитостатическая активность имеют величину порядка нескольких мВ. Поэтому данные конъюгаты имеют склонность к агрегации с белками клеточной питательной среды, что может привести к существенному падению активности препарата. Для того чтобы проверить, как изменяются активности конъюгатов при инкубировании фермента с белками клеточной питательной среды был применен метод КД-спектроскопии. При добавленной дозе EwA и EwA-PEG-chit в 10 МЕ/мл активности конъюгатов определенные в питательной среде составили 10 МЕ/мл и 8 МЕ/мл, соответственно. Это свидетельствует о том, что агрегация с белками питательной среды не влияет ни на активность нативного фермента, ни на активность конъюгата. Для контроля изменения активности препаратов в питательной среде в условиях экспермента по определению противоопухолевой активности был использован специально разработанный для этой цели метод определения L-аспарагиназной активности на основе ИК-спектроскопии. Для исследования связи конъюгатов стабильностью L-аспарагиназы в питательной среде был выбран конъюгат EwA-ПЭГ-хит (ММ 3 кДа, n(PEG)/n(chit) = 2,1), как конъюгат, проявляющий наибольшую цитостатическую активность среди всех конъюгатов. В качестве контроля использовался нативный фермент. При этом было установлено, что для нативного фермента наблюдается снижение L-аспарагиназной активности со временем. Примерно через сутки после начала инкубации начинается постепенное уменьшение активности фермента вплоть до 80 – 60% от исходной через 48 часов инкубации. Иная картина наблюдается для конъюгата EwA-ПЭГ-хитозан. Активность конъюгата сохраняется на высоком уровне в течение всего эксперимента. Это означает, что хитопэгилирование L-аспарагиназы приводит к увеличению устойчивости фермента к инактивации в питательной среде. Приведенные данные, свидетельствуют, что хотя и конъюгат обладает большей устойчивостью в питательной среде по сравнению с нативным ферментом, различие в стабильности не настолько велико, чтобы считать, что именно оно является причиной увеличенной противоопухолевой активности хитопэгилированной аспарагиназы. Скорее всего, различия в биологической активности L-аспарагиназных препаратов обусловлены другими факторами. В частности, одним из таких факторов может являться величина поверхностного заряда конъюгата. Исследование связи между дзета-потенциалом конъюгатов и их цитостатической активностью показало, что в отношении клеток относительно устойчивых к L-аспарагиназам (K-562, Jurkat) наибольшую активность проявляют конъюгаты EwA-ПЭГ-хитозан (ММ 3 и 5 кДа) с небольшой, в пределах нескольких единиц мВ, величиной дзета-потенциала. Конъюгаты с величиной дзета-потенциала порядка нескольких десятков мВ, такие как EwA-хитозан (15 – 160 кДа) не активны в отношении этих клеток. В отношении клеток хорошо восприимчивых к L-аспарагиназам (MCF7, частично Raji) активны конъюгаты как с высоким, так и с низким дзета-потенциалом. Зависимость цитостатической активности L-аспарагиназных препаратов от величины их поверхностного заряда может указывать на то, что для проявления цитостатической активности L-аспарагиназа должна сорбироваться на поверхности клеток. Для более детального понимания механизма действия L-аспарагиназ изучена адсорбция L-аспарагиназы на клеточной поверхности. Адсорбция препаратов L-аспарагиназы на клеточной поверхности были исследованы на примере EwA-ПЭГ-хит (ММ 3 кДа, n(PEG)/n(chit) = 2,1) в сравнении с нативным ферментом. Было установлено, что и для нативной и для модифицированной аспарагиназы наблюдается сорбция фермента на клеточной поверхности. Дальнейшее изучение связи между адсорбционной способностью препаратов и их цитостатической активностью может пролить свет на новые детали механизма действия L-аспарагиназных препаратов. 1) Соколов Н.Н.. Эльдаров М.А., Покровская М.В., Александрова С.С., Абакумова О.Ю., Подобед О.В., Мелик-Нубаров Н.С., Кудряшова Е.В., Гришин Д.В., Арчаков А.И.// Бактериальные рекомбинантные L-аспарагиназы: свойства, строение и антипролиферативная активность// Биомед. химия, 2015, 61(3), с. 312-324 2) Суховерков К.В., Абакумова О.Ю. , Подобед А.А., Соколов Н.Н., Кудряшова Е.В.// Образование конъюгатов с со-полимерами ПЭГ-хитозана увеличивает каталитическую эффективность и противоопухолевую активность рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora// Вестник МГУ Серия: Химия, принята в печати в 2016 году 3) Кудряшова Е.В., Суховерков К.В., Соколов Н.Н.// Применение со-полимеров ПЭГ-хитозана для регуляции каталитических свойств ферментных препаратов медицинского назначения на примере рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora// Биомед. химия, 2015, 61(4), с.480-487. 4) Sokolov N. N., Eldarov M. A., Pokrovskaya M. V., Aleksandrova S. S., Abakumova O. Yu., Podobed O. V., MelikNubarov N. S., Kudryashova E. V., Grishin D. V., and Archakov A. I.// Bacterial Recombinant L Asparaginases: Properties, Structure, and Antiproliferative Activity// Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry, 2015, 9(4), pp. 325–338. 5) Kudryashova E.V., Sukhoverkov K.V.// «Reagent-free» L-asparaginase enzyme activity assay based on CD spectroscopy and conductometry// Analytical and Bioanalytical Chemistry, DOI: 10.1007/s00216-015-9222-0 6) Deygen IМ, Kudryashova Е.V. // New versatile approach for analysis of PEG content in conjugates and complexes with biomacromolecules based on FTIR spectroscopy// Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, COLSUB-D-15-01307R1 принято, в печать 7) Суховерков К.В., Кудряшова Е.В. //Регуляция каталитических свойств рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora с использованием разветвленных со-полимеров хитозана// статья в журнале Биохимия, 2015, 80(1), с. 142 – 149 8) Суховерков К.В., Кудряшова Е.В.// Новый высокоэффективный метод определения активности L-аспарагиназы на основе ИК-спектроскопии// статья в сборнике «Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты биотехнологии», с. 246-252, Иркутск, 2015 9) И.М.Дейген, Е.В.Кудряшова// FTIR-спектроскопия: высокоэффективный метод анализа структуры и состава биополимеров// статья в сборнике «Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты биотехнологии», с. 202 - 208, Иркутск, 2015 10) Abakumova O.Yu, Podobed O.V., Karalkin P.F., Kondakova L.I., and N.N.Sokolov Antitumor activity of L-asparaginase from Erwinia carotovora against different human and animal leukemic and solid tumor cell lines. Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry (2012) 6(4):306-315. 11) Kuchumova A.V, Krasotkina Y.V., Khasigov P.Z., Sokolov N.N. «Modification of Recombinant Asparaginase from Erwinia Carotovora with Polyethylene Glycol 5000. Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry (2007) 1(4):230-232. 12) Кудряшова Е.В., Суховерков К.В., Соколов Н.Н. Применение со-полимеров ПЭГ-хитозана для регуляции каталитических свойств рекомбинантной L-аспарагиназы Еrwinia carotovora. Биомед. химия (2014), 16-27. 13) E.V. Kudryashova, K.V. Suhoverkov, N.N. Sokolov. «PEG-chitosan branched copolymers to improve the biocatalytic properties of recombinant L-asparaginase Erwinia carotovora» Biochemistry (Moscow) Series B Biomedical Chemistry 2014 v.8, no.3 252-259. 14) М.В. Покровская, В.С. Покровский, С.С. Александрова, Н.Ю. Анисимова, Р.М. Андрианов, Е.М. Трещалина, Г.В. Пономарев, Н.Н. Соколов. Рекомбинантная внутриклеточная L-аспарагиназа Rhodospirillum rubrum с низкой L-глутаминазной активностью и антипролиферативным эффектом. 2013. Биомедицинская химия, том 59, вып. 2, с. 192-208. 15) Pokrovskaya M.V., Aleksandrova S.S., PokrovskyV.S., Veselovsky A.V., Grishin D.V.,Abakumova O.Y., Podobed O.V., Mishin A.A., Zhdanov D.D., Sokolov N.N..// Identification of Functional Regions in the Rhodospirillum rubrum L-Asparaginase by Site-Directed Mutagenesis.// Mol. Biotechnol., 2015, 57, с. 251-264 16) Покровский В.С., Комарова М.В., Александрова С.С., Покровская М.В., Калишьян М.С., Каршиева С.Ш., Трещалина Е.М.// Роль ферментативной активности в реализации антипролиферативного эффекта L-аспарагиназ// Клиническая онкогематология: фундаментальные исследования и клиническая практика, 2015, 8(2), pp. 120 – 128
3 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. РЕГУЛЯЦИЯ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНОЙ L-АСПАРАГИНАЗЫ ERWINIA CAROTOVORA С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СО-ПОЛИМЕРОВ ПЭГ-ХИТОЗАНА
Результаты этапа: 1) Наработаны высокоочищенного (90-95%-ной степени чистоты) препаратов рекомбинантной L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum (RrA) и Wolinella succinogenes (WsA) в количестве, необходимом для проведения серии экспериментов посвященных характеристики энзимологических и биологических свойств ферментов. Получение L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum (RrA) осуществляли по стандартной методике описанной в работе [1]. Ген RrA был клонирован в вектор pET23a по сайтам рестрикции HindIII и Bam НI и экспрессирован в штамме E. coli BL21 (DE3). Для выделения фермента биомассу подвергали ультразвуковой обработке с целью разрушения бактериальных клеток. Полученный экстракт подвергали последовательным хроматографиям на носителях Q-Sepharose и DEAE-Toyopearl, обессоливанию и лиофилизации. Выход фермента составляет 30 – 40%, а чистота полученного продукта – 95%. При исследовании полученного белка было установлено, что L-аспарагиназа R. rubrum существует в виде димерной формы. Молекулярная масса мономера RrA, по данным масс-спектрометрии, составила 19,1 кДа, по данным электрофореза - 20 кДа. Фермент имеет следующие физико-химические и каталитические характеристики: Km для L-аспарагина 0,22 мM, удельная активность 40 МЕ/мг, оптимум pH 9,2; температуры 54°С; pI 5,1. Следует особо отметить, что L-глутаминазная активность фермента составляет не более 0,1% от L-аспарагиназной. Получение L-аспарагиназы Wolinella succinogenes (WsA) осуществляли по стандартной методике описанной в работе [2]. Ген WsA был клонирован в вектор pET28b+ по сайтам рестрикции NcoI и XhoI и экспрессирован в штамме E. coli BL21 (DE3). Для выделения фермента биомассу подвергали обработке френч-прессом с целью разрушения бактериальных клеток. Полученный экстракт подвергали центрифугированию с последующим растворением полученного осадка и его хроматографической очистке на носителях SP-Sepharose и Q-Sepharose, обессоливанию и лиофилизации. Выход фермента составляет 30 – 40%, а чистота полученного продукта – 95%. При исследовании полученного белка было установлено, что L-аспарагиназа W. succinogenes существует в виде тетрамерной формы. Молекулярная масса мономера WsA, по данным электрофореза – 37 кДа. Фермент имеет следующие физико-химические и каталитические характеристики: Km для L-аспарагина 0,048 мM, удельная активность 150 МЕ/мг, оптимум pH 7,3; температуры 54°С; pI 5,1. При этом L-глутаминазная активность фермента составляет не более 1% от L-аспарагиназной. 2) Для исследования возможностей использования хитопэгилирования к регуляции каталитических свойств ферментов медицинского назначения были синтезированы и изучены конъюгаты L-аспарагиназ RrA и WsA с ПЭГ-хитозаном, различающиеся по структуре и составу. Чтобы получить препараты на основе RrA и WsA, обладающие оптимальными биофармацевтическими свойствами, было исследовано влияние состава конъюгатов на каталитическую активность фермента, а также влияние образования фермент-полиэлектролитных комплексов на активность фермента. Синтез конъюгатов с производными хитозана различного состава, осуществляли по реакции восстановительного аминирования между свободными аминогруппами фермента и восстанавливающим концом молекул хитозана. В рамках проекта был синтезирован и исследован ряд конъюгатов аспсрагиназы с со-полимерами хитозана различного состава. Молекулярную масса использованных хитозанов варьировали в пределах от 3 до 160 кДа, а содержание цепей ПЭГ от 1 до 40 цепей ПЭГ на одну цепь хитозана. Анализ состава и степени очистки полученных конъюгатов проводили в несколько этапов, следуя схеме разработанной на примере EwA [3–5]: разделение методом ВЭЖХ в режиме гель-фильтрации; анализ состава полученных фракций методов УФ-видимой спектрофотомерии, ИК. При помощи ВЭЖХ и УФ-видимой спектроскопии было установлено, что используемый при проведении модификации L-аспарагиназ для очистки реакционной смеси метод ультрафильтрации позволяет добиться полного отделения непрореагировавших полимеров и немодифицированного фермента. Анализ состава полученных конъюгатов методом ИК-спектроскопии показывает, что в случае L-аспарагиназ RrA и WsA в среднем на одну белковую глобулу приходится 3 – 5 цепей полимера. Стоит особенно отметить, что согласно данным КД и ИК спектроскопии вторичная структура белка в составе конъюгатов не отличается от нативной, как и в случае EwA, что свидетельствует о том, что метод хитопэгилирования может быть без опаски применен для модификации ферментов из различных источников. Для определения каталитической активности полученных конъюгатов был применен ранее разработанный метод на основе спектроскопии КД [6]. Обнаружено, что удельные активности конъюгатов зависят от ММ хитозана, от типа связывания полимера с ферментом (ковалентно-нековалентно) и от наличия и природы заместителя. Так, конъюгаты с ПЭГ-хитозаном (ММ 5 – 15 кДа) характеризуются более высокой каталитической активностью (в 1,2 – 2 раза в зависимости от состава полимера и фермента) по сравнению с нативным ферментом. Найдено, что для каждого фермента существует свое оптимальное значение ММ и степени ПЭГилирования полимера. Так для RrA наибольшее увеличение каталитической активности при физиологических условиях (активность нативной RrA 50 – 60 МЕ/мг, активность конъюгата с ПЭГ-хитозаном составляет 120 – 140 МЕ/мг) наблюдается при n(PEG)/n(chit) = 3 – 4 и ММ хитозана 3 кДа. Для WsA оптимум наблюдается при n(PEG)/n(chit) = 6 – 8 и ММ хитозана 5 кДа, активность фермента при этом увеличивается со 150 до 200 МЕ/мг. Нами было установлено, что главным образом эффект от хитопэгилирования связан со смещением рН оптимума фермента в область физиологических значений рН. Так при образовании конъюгатов для EwA рН оптимум смещается с 8 – 8,5 в область 6,5 – 7,5, а для RrA с 9,2 – 9,5 в область 8 – 8,5. Интересно отметить, что хитопэгилирования оказывает тем больший эффект на удельную активность фермента чем больше его рН оптимум сдвинут в щелочную область. Так, в то время как для RrA и EwA активность конъюгатов в 2 – 3 раза превышает активность нативных ферментов, для WsA, чей рН оптимум находится в области 7,3 – 7,5 хитопэгилирование не приводит к существенному увеличению активности. 3) Для получения мутантных форм RrA D60K и F61L, R118H, и G120R с повышенной каталитической активностью стабильностью, E149R и V150P с повышенной противоопухолевой активностью, стабильностью, а также сниженной иммуногенностью была использована методика из работы [7]. Мутантные последовательности получали методом “Quick Change Site-Directed Mutagenesis” используя стандартные процедуры описанные в [8]. Генетические последовательности соответствующих мутантов RrA были клонированы в вектор pET23a по сайтам рестрикции HindIII и Bam НI и экспрессированы в штамме E. coli BL21 (DE3). Для выделения фермента биомассу подвергали ультразвуковой обработке с целью разрушения бактериальных клеток. Полученный экстракт подвергали последовательным хроматографиям на носителях Q-Sepharose и DEAE-Toyopearl, обессоливанию и лиофилизации. Выход фермента составляет 30 – 40%, а чистота полученного продукта – 95%. При исследовании полученного белка было установлено, что основные физико-химические характеристики фермента не изменились при мутагенезе. Так мутантные формы L-аспарагиназы R. rubrum существуют в виде димеров. Молекулярная масса мономера RrA, по данным масс-спектрометрии, составила 19,1 кДа, по данным электрофореза - 20 кДаб оптимум pH 9,2; температуры 54 – 57°С; pI 5,1. Инач картина наблюдалась для каталитических особенностей мутантов. Так для мутанта D60K и F61L Km для L-аспарагина 0,23 мM, а удельная активность 170 МЕ/мг, в то время как для WT RrA она составила 40 МЕ/мг. Следует особо отметить, что L-глутаминазная активность фермента составляет не более 1% от L-аспарагиназной. Кроме того данный мутант проявил особую стабильность к денатурации под действием мочевины. Для мутантной формы R118H, и G120R результат оказался несколько хуже – несмотря на то, что удельная активность также увеличилась до 170 МЕ/мг величина Km для L-аспарагина выросла на 70 – 75%. Для мутанта E149R и V150P важным изменением в каталитических характеристиках стало увеличение Km для L-аспарагина до 0,77 мМ при сохранении прежнего уровня активности, что серьезно ограничивает перспективы применения данной мутантной формы в нативном виде. Для того чтобы выбрать форму L-аспарагиназы наиболее подходящую для создания хитопэгилированной формы RrA была исследована противоопухолевая активность мутантных форм в отношении клеток Т клеточного лейкоза линии Jurkat. При этом оказалось, что в то время как WT RrA и мутанты D60K и F61L, R118H, и G120R неактивны в отношении данных клеток, мутантная форма E149R и V150P демонстрирует выраженный дозовозависимы эффект сравнимый с таковым для коммерчески доступной L-аспарагиназы E. coli фирмы Medac. Это означает, что данная форма является наиболее перспективным объектом для хитопэгилирования, поскольку при помощи модификации ПЭГ-хитозаном удастся добиться увеличения каталитической активности фермента, которое позволит нивелировать его низкую субстратную афинность. На предыдущем этапе работы нами было установлено, что для RrA наибольшее увеличение каталитической активности при физиологических условиях наблюдается при n(PEG)/n(chit) = 3 – 4 и ММ хитозана 3 кДа. Поэтому был синтезирован конъюгат именно с этим сополимером. И оказалось, что модификация мутантной формы E149R и V150P оптимальным полимером приводит к увеличению каталитической активности мутантных на 100 – 150%. Кроме того на 20 – 30% возрастает устойчивость к трипсинолизу, а к термоденатурации на 50 – 60%, что несомненно способствует увеличению времени жизни фермента в кровотоке. Важным следствием этого фактора будет возможность увеличитьь интервал между введением доз препарат, а значит отсрочить выработку индивидуальной непереносимости, которая является главной проблемой противоопухолевой терапии с применением L-аспарагиназ. 4) Для оптимизации каталитических свойств конъюгатов L-аспарагиназ RrA и WsA с ПЭГ хитозанами было исследовано влияние молекулярной архитектуры со-полимера, на каталитические свойства, субстратную специфичность и стабильность фермента к протеолитической деградации в системах in vitro. В первую очередь было исследовано как хитопэгилирование влияет на величину Кm ферментов. Поскольку L-аспарагиназа, как лекарственный препарат, действует в физиологических условиях, в области относительно низких концентраций субстрата важно знать как модификация фермента разветвленным полимером на его способность к связыванию субстрата (параметр Кm, который является количественным критерием данного процесса). Для определения кинетических параметров L-аспарагиназы при относительно низких концентрациях субстрата (в области определения Кm) в проекте был разработан и применен метод кондуктометрии [9]. Использование метода кондуктометрии позволило определить кинетические параметры Vmax и КM, для конъюгатов и полиэлектролитных комплексов RrA и WsA с ПЭГ-хитозанами в диапазоне ММ хитозанами от 3 до 160 кДа и степеней пэгилирования от 2 до 20 цепей на цепь хитозана. Найдено, что величина Кm для всех исследованных конъюгатов и полиэлектролитных комплексов аспарагиназы с ПЭГ-хитозаном (при модификации фермента как высокомолекулярными, так и разветвленными полимерами) Km L-аспарагиназы практически не изменяется. Это означает, что применение конъюгатов L-аспарагиназ с ПЭГ-хитозаном будет эффективным в физиологических условиях - при низком содержании L-аспарагина, что обуславливает возможность их терапевтического применения. Таким образом, результатом оптимизации молекулярной архитектуры и состава конъюгатов является увеличение каталитической эффективности фермента (kcat/KМ) в отношении L-аспарагина при физиологических условиях в 1,5–2 раза для RrA и 1,2 – 1,5 для WsA. Следующим этапом работы стала определение субстратной специфичности полученных конъюгатов, а имено их L-глутаминазной активности. L-глутаминазная активность является важнейшей характеристикой L-аспарагиназных препаратов, влияющей на токсичность препарата для человеческого организма и опухолевых клеток. При длительном терапевтическое применение препаратов L-аспарагиназы именно L-глутаминазная активность фермента обуславливает развитие ряда опасных побочных реакций (гепатотоксичность, нефротоксичность, тромбозы, осложнения со стороны ЦНС и др.). Поэтому необходимо исследовать, как хитопэгилирование влияет на L-глутаминазную активность L-аспарагиназы. L-глутаминазная активность препаратов EwA и ее конъюгатов с ПЭГ-хитозаном с применением метод КД спектроскопии, разработанного в проекте [9]. Найдено, что удельная активность по L-глутамину для конъюгатов RrA и WsA с ПЭГ-хитозанами не отличаются по абсолютному значению от нативного фермента. Это означает, что конъюгирование повышает субстратную специфичность – т.е. активность по L-аспарагину повышается, а относительное значение активности в отношении L-глутамина падает с 0,1 до 0,03% для RrA и с 1 до 0,6% для WsA при использовании ПЭГ-хитозанов с оптимальными ММ и степенью ПЭГилирования. Это означает, что при использовании одной и той же действующей дозы нативного фермента и хитопэгилированного препарата можно ожидать, что применение последнего будет сопровождаться менее интенсивными побочными эффектами, обусловленными L-глутаминазной активностью. Хитопэгилирование оказывает значительное влияние не только на каталитические свойства фермнтов, но и на их стабильность. Так было показано, что связывание RrA и WsA с ПЭГ-хитозанами значительно увеличивает их устойчивость к термоинактивации, снижая константу термоинактивации при температуре 45оС на 30 – 40% в зависимости от состава сополимера. Это качество делает конъюгаты аспарагиназы с производными хитозана перспективной основой для создания стабилизированного ферментного препарата. Кроме того в проекте исследовано влияние молекулярной архитектуры и состава конъюгатов на стабильность L-аспарагиназных препаратов к протеолитической деградации. Протеолитическая деградация L-аспарагиназных препаратов под действием содержащихся в крови трипсиноподобных протеаз является одним из важных факторов снижающих время жизни фермента в кровотоке. Была исследована стабильность к протеолизу следующих конъюгатов RrA-ПЭГ-хитозан (3 кДа, n(PEG)/n(chit) = 3 – 4), WsA-ПЭГ-хитозан (5 кДа, n(PEG)/n(chit) = 6 – 8), и RrA-хитозан (3 кДа), а также WsA-ПЭГ-хитозан (5 кДа). Показано, что связывание фермента с ПЭГ-хитозанами существенно увеличивает его устойчивость к трипсинолизу (снижая константу инактивации фермента в 1.5-2 раза), в то время как немодифицированный хитозан не позволяет достичь такого эффекта. Также было установлено, что увеличение стабильности фермента при использовании высокомолекулярного, но неразветвленного хитозана (ММ 160 кДа) и низкомолекулярного, но разветвленного ПЭГ-хитозана примерно одинаково. Это означает, что хитопэгилирование является перспективным методом стабилизации L-аспарагиназ, поскольку хитопэгилирование позволяет добиться одновременного увеличения стабильности и активности препаратов. 5) Для конъюгатов L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum и его мутантной формы с со-полимерами оптимального состава (с точки зрения каталитической активности и стабильности) будет изучена, в сравнении с коммерческими лекарственными препаратами нативной и пегилированной форм L-аспарагиназ E.coli, противоопухолевая активность in vitro на культурах клеток К562, MDA-MB-231, MCF7, обладающих статистически значимой чувствительностью к RrA [1]. Исследованные клеточные линии можно разделить на две группы 1) чувствительные к L-аспарагиназам: клетки рака молочной железы– MDA-MB-231, MCF7, клетки рака предстательной железы DU145 и клетки хронического миелоидного лейкоза К562 имеющие механизм резистентности к действию L-аспарагиназ за счет не до конца сниженной активностью L-аспарагинсинтетазы [5,6]. В качестве основы для создания конъюгатов использовался мутант RrA E149R, V150P, обладающий повышенными стабильностью и противоопухолевой активностью. Полученные результаты свидетельствуют, что хитопэгилирование значительно увеличивает активность RrA в отношении клеточных линий К562 и MCF7 по сравнению с нативным ферментом. Наиболее выдающиеся результаты были получены для конъюгатов RrA с хитозанами ММ 5 – 7 кДа и n(PEG)/n(chit) = 3 – 6, для которых уменьшение IC50 по сравнению с нативным ферментом составило 20 – 30% для клеток К562 и 40 – 50% для клеток MCF7. При этом наблюдаемый эффект проявлялся в тем большей степени чем больше была ММ ПЭГ-хитозана. Необходимо отметить, что конъюгаты с немодифицированными хитозанами продемонстрировали такую же активность как и нативный фермент, что свидетельствует о критическом значении пэгилирования. Ранее аналогичные данные были получены для конъюгатов EwA, что позволяет предположить, что метод хитопэгилирования работает вне зависимости от происхождения фермента, поэтому решено было продолжить работы по оптимизации молекулярной архитектуры и состава конъюгатов L-аспарагиназ в направлении поиска наиболее оптимума ММ и степени пэгилирования. В качестве модельных соединений для этого было исследовано несколько групп конъюгатов EwA с ПЭГ-хитозанами ММ которых изменялась в пределах от 5 до 20 кДа, а степень пэгилирования от 4 до 16 цепей ПЭГ на цепь хитозана. В качестве модельных клеточных линий были использованы клетки хронического миелоидного лейкоза (К562) и промиелоцитарного лейкоза (HL60). Следует особо отметить, что в то время как клетки HL60 достаточно чувствительны к L-аспарагиназам, клетки К562 обладают механизмом резистентности к ним. Выбор данных систем был обусловлен тем, что позволяет наиболее яркого проявить влияние хитопэгилирования на цитостатическую активность L-аспарагиназ как в случае резистентных, так и в случае чувствительных клеток. При этом было установлено, что для обеих клеточных линий цитостатическая активность конъюгатов EwA находится в прямой зависимости от степени пэгилирования используемого хитозана. Так в случае конъюгата с ПЭГ-хитозаном ММ 7 кДа увеличение степени пэгилирования с 4 до 16 цепей ПЭГ на цепь хитозана приводит к снижению IC50 c 15 МЕ/мл до 4,6 МЕ/мл в случае клеток К562 и с 13 МЕ/мл до 2,9 МЕ/мл в случае клеток HL60. При этом оптимум ММ хитозана находится при 5 – 7 кДа, её снижение или увеличение ведет к снижению цитостатической активности. Для того чтобы выяснить молекулярные причины наблюдаемого эффекта были измерены дзета-потенциалы конъюгатов. При этом оказалось, что в то время как для конъюгатов с хитозаном величина дзета-потенциала составляет около 10 мВ, для конъюгатов с ПЭГ-хитозанами она находится в районе 0, так же как и для нативной L-аспарагиназы, где дзета-потенциал близок к нулю. Отсюда следует, что низкая величина дзета-потенциала является необходимым, но не достаточным условием для проявления конъюгатом цитостатической активности. Одной из основных причин данного эффекта может быть поликатионная природа хитозана. Так известно, что отрицательно заряженная поверхность опухолевых клеток способна адсорбировать поликатионы, приобретая при этом положительный заряд [10]. Применительно к данной системе это означает, что при использовании конъюгатов с непэгилированным хитозаном такая адсорбция может привести к уменьшению локальной концентрации вблизи поверхности клетки за счет электростатического отталкивания. В случае же конъюгатов с ПЭГ-хитозанами их дзета-потенциал должен быть близок к нулю за счет модификации и экранирования аминогрупп и подобного явления наблюдаться не должно. После установления оптимального с точки зрения проявляемой цитостатической активности состава решено было применить полученные закономерности для синтеза конъюгата с WsA. Для данного фермента был получен конъюгат с ПЭГ-хитозаном ММ 5 кДа, содержащего 8 цепей ПЭГ, который теоретически должен был обладать наибольшей противоопухолевой активностью. И действительно, оказалось, что для данного конъюгата с ПЭГ-хитозаном IC50 для клеток К562 составила менее 0,2 МЕ/мл, что является выдающимся результатом для L-аспарагиназного препарата, ведь рост данных клеток не подавляется ни EwA ни коммерчески доступными препаратами нативной и пэгилированной EcA. 6) Для создания эффективных противоопухолевых препаратов на основе L-аспаргиназ необходимо детальное понимание механизма каталитического действия фермента. В настоящее время, несмотря на длительное применение L-аспарагиназ в медицинской практике подробный механизм их действия остается неясным. Для выяснения какая олигомерная форма фермента обладает наибольшей каталитической активностью, исследована связь между олигомерным составом фермента и его активностью, а также изучить влияние хитопэгилирования на олигомерный состав L-аспарагиназ. Исследование проводили с привлечением методов: мицеллярной энзимологии, ультрацентрифугирование, ВЭЖХ, ИК и КД-спектроскопия. В качестве объектов исследования были использованы конъюгаты EwA с хитозаном ММ 7кДа и ПЭГ-хитозаном (ММ 7 кДа, n(PEG)/n(chit) = 8), полиэлектролитный EwA комплекс с тем же полимером и нативный фермент. Для исследования олигомерного состава методами мицеллярной энзимологии L-аспарагиназу EwA солюбилизировали в системе вода-октан-докузат натрия (АОТ) в виде обращенных мицелл с различной степенью гидратации и определяли активность фермента в отношении L-аспарагина. При этом было установлено, что зависимость актвиности фермента от степени гидратации носит немонотонный характер с двумя максимумами, что может указывать на наличие двух олигомерных форм с разной активностью. Исходя из строения L-аспарагиназы Erwinia carotovora это могут быть димер фермента и димер димеров [12]. Интересно отметить, что при анализе нативной L-аспарагиназы методом ВЭЖХ гель-фильтрации фермент удается наблюдать только одну фракцию соответствующую по ММ тетрамерной форме фермента, аналогичные результаты для нативного фермента получаются и при ультрацентрифугировании. По-видимому, это означает что нативная L-аспарагиназа в водных растворах существует исключительно в виде тетрамера и для фиксации димерной формы необходимо создавать особые условия. Иная картина наблюдается при модификации L-аспарагиназы ПЭГ-хитозаном. Так, при седиментационном анализе конъюгата не подвергнутого очистке от избытка хитозана методом ультрафильтрации помимо основной фракции, соответствующей конъюгату тетрамера L-аспарагиназы и ПЭГ-хитозана (ММ 220 кДа) наблюдается низкомолекулярная фракция с ММ между 50 и 100 кДа. ИК-спектрах данного вещества содержит характерные для белков пики амид I и II, а также пик эфирных связей ПЭГ характерный для конъюгатов с ПЭГ-хитозаном. КД-спектр свидетельствует о присутствии в данной фракции α-спиралей, а форма плавления кривой ДСК о том, что в данном веществе присутствует два структурных домена. Исходя из этих данных, нами было выдвинуто предположение, что модификация ПЭГ-хитозаном способствует стабилизации димерной формы L-аспарагиназы в водном растворе. Интересно отметить, что данная фракция обладает L-аспарагин-синтетазной активностью, величина которой, впрочем, в 10 – 12 раз ниже, чем у нативного фермента, хотя в литературе неоднократно отмечалось, что у тетрамерных L-аспарагиназ активны лишь тетрамерные формы [12,13]. Из литературных данных известно, что тетрамер L-аспарагиназы Erwinia carotovora содержит 4 активных центра, которые находятся в области контакта между N- и C-доменами, различных мономеров [11]. То есть одного димера может быть вполне достаточно для осуществления каталитической функции. Поэтому наиболее вероятной причиной образования активного димера при модификации ПЭГ-хитозаном может быть изменение конформации белка в результате электростатического взаимодействия «активирующеее» активный центр. Таким образом, хитопэгилирование открывает новые возможности для контроля над процессом олигомеризации L- аспарагиназы, что может быть полезно для исследования связи между строением фермента и его каталитической активностью. Более того, контроль олигомеризации L-аспарагиназ рассматривается в настоящее время активно обсуждается как один из путей к снижению побочных эффектов связанных с повышенной иммуногенностью L-аспарагиназных препаратов [11]. 7) Исследована возможность создания новой лекарственной формы аспарагиназы для подкожного введения, разрабатывали депонирующию систему на основе хитозановых микрочастиц содержащих аспарагиназу, которая могла бы позволить осуществлять контролируемое высвобождение препарата в кровь в течение длительного времени. Формировали конъюгаты L-аспарагиназы EwA с хитозаном на основе хитозана высокой ММ (160 кДа). Частицы получали с использование использование микропористой мембраны, разделяющей две жидкости. При перекачивании одной жидкости в другую можно получить микрочастицы на выходах из пор мембраны. Хитозан является pH-чувствительным полимером: при низких значениях pH аминогруппы хитозана протонированы и положительно заряжены, и хитозан является водорастворимый полиэлектролитом. При высоком pH амины депротонируются, полимер теряет свой заряд и становится нерастворимым. Для получения наночастиц на основе хитозана раствор хитозана в 10-3M HCl (pH = 3.0) и раствор щелочи (pH = 9.6) помещали по разные стороны мембраны, создав тем самым поток жидкости, при котором раствор с низким рН перетекал в раствор с высоким рН (под давлением). Наночастицы образуются у отверстий нанопористой мембраны при контакте раствора хитозана с раствором с высоким рН, вызывающим образование хитозанового осадка. Хитозановые наночастицы сразу же удаляются от мембраны благодаря непрерывному потоку жидкости. Методом ИК-спектроскопии по изменению интенсивности полос поглощения отвечающих амидным группам фермента было установлено, что эффективность включения L-аспарагиназы в состав частиц находится на уровне 40 – 50% Исследования формы частиц проведенные методом СЭМ показывают, что в твердом виде они имеют сферическую форму и размер порядка 300 – 500 нм. При попадании в физиологические условия (рН 7,4, ионная сила 0,1 М) в течение первых часов происходит набухание частиц в 1,5 – 2 раза с последующим уменьшением размера по мере выхода фермента и полным разрушением частиц в течение 10 – 12 дней. Для исследования кинетики высвобождения фермента был применен метод ультрафильтрации через пористые мембраны, который позволяет отделить сравнительно небольшие молекулы фермента от крупных частиц. При этом было установлено, что данный процесс носит двухстадийный характер. В первую очередь в течение 1,5 – 2 часов высвобождаются молекулы фермента находящиеся на поверхности частиц, а затем в течении 5 – 7 дней высвобождается фермент включившийся вглубь частиц. Для характеристики каталитических параметров EwA в составе частиц был применен метод рН-статирования. При этом было установлено, что Кm остается неизменной, на уровне нативного фермента (порядка 0,05 мМ), а активность значительно уменьшается с 500 – 600 МЕ/мг до 40 – 60 МЕ/мг. Одной из возможных причин такого явления может быть частичная денатурация фермента при его включении в состав частиц и последующем высвобождении оттуда. Для проверки данной гипотезы растворы наночастиц подвергались ВЭЖХ для отделения от выделившегося фермента с последующим анализом фракций методом ИК-спектроскопии. При этом оказалось, что он выделяется не в нативном виде, а в форме полиэлектролитного комплекса с хитозаном в соотношении n(chit)/n(enz) = 3 – 5. Анализ КД-спектров данного комплекса убедительно оказал, что вторичная структура фермента остается неизменной, что означает, что данный метод применим может быть использован для синтеза фермент-полимерных наночастиц. [1] М.В. Покровская, В.С. Покровский, С.С. Александрова, Н.Ю. Анисимова, Р.М. Андрианов, Е.М. Трещалина, Г.В. Пономарев, Н.Н. Соколов, РЕКОМБИНАНТНАЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ L-АСПАРАГИНАЗА RHODOSPIRILLUM RUBRUM С НИЗКОЙ L-ГЛУТАМИНАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ И АНТИПРОЛИФЕРАТИВНЫМ ЭФФЕКТОМ, Биомедицинская Химия, 59 (2013) 192–208. [2] E.P. Sannikova, N. V Bulushova, S.E. Cheperegin, I.I. Gubaydullin, G.G. Chestukhina, V. V Ryabichenko, I. a Zalunin, E.K. Kotlova, G.E. Konstantinova, T.S. Kubasova, a a Shtil, V.S. Pokrovsky, S. V Yarotsky, B.D. Efremov, D.G. Kozlov, The Modified Heparin-Binding L-Asparaginase of Wolinella succinogenes, Mol. Biotechnol., (2016). [3] E. V Kudryashova, K. V Sukhoverkov, N.N. Sokolov, Application of PEG-chitosan copolymers for regulation of catalytic properties of enzymes for medical application using recombinant Erwinia carotovora L-asparaginase as an example, Biochem. Suppl. Ser. B Biomed. Chem., 8 (2014) 252–259. [4] Е.В. Кудряшова, К.В. Суховерков, Н.Н. Соколов, ПРИМЕНЕНИЕ СО-ПОЛИМЕРОВ ПЭГ-ХИТОЗАНА ДЛЯ РЕГУЛЯЦИИ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНОЙ L-АСПАРАГИНАЗЫ ERWINIA CAROTOVORA, Биомедицинская Химия, 61 (2015) 480–487. [5] К.В. Суховерков, Е.В. Кудряшова, Pегуляция каталитических свойств рекомбинантной l-аспарагиназы Erwinia carotovora с использованием ПЭГ-хитозана и гликоль-хитозана, Биохимия, 80 (2015) 142–149. [6] E. V Kudryashova, K. V Sukhoverkov, “Reagent-free” L-asparaginase activity assay based on {CD} spectroscopy and conductometry, Anal Bioanal Chem, 408 (2015) 1183–1189. [7] M. V Pokrovskaya, S.S. Aleksandrova, V.S. Pokrovsky, a V Veselovsky, D. V Grishin, O.Y. Abakumova, O. V Podobed, a a Mishin, D.D. Zhdanov, N.N. Sokolov, Identification of Functional Regions in the Rhodospirillum rubrum L-Asparaginase by Site-Directed Mutagenesis, Mol. Biotechnol., 57 (2014) 251 – 254. [8] M. Green, Molecular cloning : a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, 2012. [9] E. V. Kudryashova, K. V. Sukhoverkov, «Reagent-free» L-asparaginase enzyme activity assay based on CD spectroscopy and conductometry, Anal. Bioanal. Chem., 408 (2016) 1183–1189. [10] O. V. Bondar, D. V. Saifullina, I.I. Shakhmaeva, I.I. Mavlyutova, T.I. Abdullin, Monitoring of the Zeta Potential of Human Cells upon Reduction in Their Viability and Interaction with Polymers, Acta Naturae, 4 (2012) 78. [11] Ю.В. Мезенцев, А.А. Мольнар, О.В. Гнеденко, Ю.В. Красоткина, Н.Н. Соколов, А.С. Иванов, Г.У. Нии, В.Н. Ореховича, Олигомеризация L-аспарагиназы из Еrwinia carotovora, Биомедицинская Химия, 52 (2006) 258–271. [12] K. Michalska, M. Jaskolski, Structural aspects of l -asparaginases , their friends and relations, Acta Biochim. Pol., 53 (2006) 627–640. [13] Н.Н. Соколов, В.А. Занин, С.С. Александрова, Бактериальные L-аспарагиназы и глутамин(аспарагин)азы: некоторые свойства, строение и противоопухолевая активность, Вопросы Медицинской Химии, 46 (2000) 531–548.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".