ИСТИНА

LpD, или Дигидролипоамиддегидрогеназа, - это фермент, который входит в состав некоторых мультиферментных комплексов (пируват дегидрогненазный комплекс, альфа-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс, а также дегидрогеназа аминокислот с разветвленной цепью). LpD содержит реакционноспособную дисульфидную группу S-S и кофактор FAD и катализирует реакцию окисления дигидролипоамида в составе другого фермента, Е2, с образованием липоамида. При этом FAD восстанавливается до FADH2, и для его обратного окисления необходим второй субстрат - NAD+. Кристаллическая структура для LpD из E coli известна для апоформы (разрешение 2,5 Å). Для детального описания каталитического механизма и взаимодействия LpD с белковыми партнерами необходимо получить структуры его комплексов с субстратами - липоамидом и/или NADH, а также повысить разрешение структуры апоформы. В рамках данного исследования планируется разработка методики получения и очистки LpD из E. coli, наработка препаративных количеств белка, характеристика его пригодности для структурных исследований, скрининг условий кристаллизации комплексов LpD с субстратами, оптимизация методики кристаллизации апоформы и адаптация ее к условиям микрогравитации (для последующего эксперимента на МКС). Проведение эксперимента в условиях микрогравитации (на МКС) позволит получить структуру LpD в комплексе с субстратом.

Разработана методика получения и очистки рекомбинантного LpD из E. coli. Наработаны препаративные количества белка, найдены условия получения комплексов с субстратами - NADH и липоамидом. Охарактеризованы физико-химические параметры и пригодность для структурных исследований. Методом SAXS определены условия существования белка без образования агрегатов. Белок был наработан в препаративных количествах и использован для поиска условий кристаллизации. Найдены условия кристаллизации для комплекса LpD с NADH методом висячей капли, а также для комплекса LpD с липоамидом в капилляре для последующего эксперимента на МКС.