ИСТИНА

Скелетные мышцы обладают высокой степенью пластичности и способны отвечать на состояние функциональной разгрузки (вызванное иммобилизацией, микрогравитацией, длительным постельным режимом, или повреждением нерва и др.) атрофией (потерей мышечной массы) и атонией (снижением жесткостных свойств). Атрофия, вызванная функциональной разгрузкой, обусловлена снижением белкового синтеза и резким увеличением белкового распада (Glass DJ.., 2003, S.Bodine, 2014, S.Kandarian и др., 2004), в результате чего снижается содержание сократительных и цитоскелетных белков. Для постуральных мышц (например, камбаловидная мышца), наиболее подверженных атрофическим процессам, вклад убиквитин-протеасомной системы в деградацию белков особенно велик, т.к. она отвечает за 80-90% круговорота цитоплазматического белка, доступного для протеолиза (S. Cohen и др., 2009). Развитие описанных феноменов обусловлено изменениями экспрессии ключевых белков: E3 убиквитин лигаз, определяющих интенсивность протеасомного пути белковой деградации, а также изменениями титина. Титин (тайтин, коннектин) – гигантский эластичный мышечный белок, отвечающий за поддержание структуры и биомеханических свойств мышц, а также играющий важную роль в процессах внутриклеточной сигнализации. Упруго-эластичные свойства молекул титина определяют жесткость мышечных волокон, от которой напрямую зависит их тонус. Целью нашего исследования является выявление триггерных механизмов, регулирующих экспрессию генов основных мышечных E3-убиквитин лигаз (atrogin-1 и MuRF-1) и гигантского белка саркомерного цитоскелета титина на ранних этапах функциональной разгрузки скелетных мышц. Ранее было показано, что белки MuRF-1 и MuRF-2 связаны с титином (Labeit S. et al., 2002), и при функциональной разгрузке мышц отсоединяется от него когда титиновая пружина расслабляется. Известно также, что тяжёлые цепи миозинов, которые занимают до 70% объёма мышечных волокон, и являются субстратом этих Е3-лигаз. Именно поэтому нам интересно исследовать ранние сроки функциональной разгрузки, чтобы застать начало этого процесса. Одной из фундаментальных задач в рамках указанной проблемы является 1) исследование роли гистондеацетилаз (HDAC1,HDAC 4/5) в активации транскрипционных факторов FOXO и миогенина при функциональной разгрузке мышц в экспрессии генов atrogin-1 и MuRF-1. Выявив механизмы, контролирующие деградацию мышечных белков при разгрузке, мы сможем разработать систему фармакологической коррекции атрофических процессов в мышце. Следующей важной задачей проекта является: 2) исследование регуляции экспрессии гена титина (играющего существенную роль в развитии процесса атонии мышцы) при функциональной разгрузке. В скелетных мышцах млекопитающих и человека экспрессируются изоварианты N2A-изоформы титина с м.м. 3.3–3.7 МДа, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга (Bang et al., 2001). Недавно показано, что РНК-связывающийся белок Rbm20 регулирует альтернативный сплайсинг и экспрессию изовариантов N2BA и N2B-изоформ титина в сердечной мышце (Shijun Li et al., 2013). Обнаружено также, что гистондеацетилазы (HDACs) класса IIa участвуют в реакциях со специфическими транскрипционными факторами и, находясь в ядре, усиливают транскрипционную репрессорную функцию в поперечно-полосатых и гладких мышцах (Di Griorgio, Brancolini, 2016; Gaur et al., 2016). В этом проекте мы впервые предлагаем исследовать роль Rbm20, а также HDACs класса IIa в регуляции альтернативного сплайсинга и экспрессии изовариантов N2A-изоформы титина в скелетной мышце soleus при моделировании гравитационной разгрузки. Будут также впервые исследоваться динамика экспрессии пре-мРНК титина и ее сплайсинг на разных сроках разгрузки. Важным вкладом в исследование проблемы регуляции экспрессии ключевых белков является выявление 3) влияния мышечного тонуса на развитие атрофических изменений и его роли в регуляции экспрессии ведущих генов, контролирующих деструкцию сократительных и цитоскелетных мышечных белков. Известно, что при гипокинезии снижается мышечный тонус, что может вызвать атрофию мышцы, привести к изменению экспрессии Е3 лигаз и других генов, контролирующих экспрессию ключевых мышечных белков. Введением тетанотоксина (столбнячного токсина) при разгрузке мышцы можно искусственно повысить её тонус. Мы собираемся ввести этот препарат в m.soleus при 7-ми суточной функциональной разгрузке и ожидаем в результате добиться предотвращения (или снижения) экспрессии основных убиквитин лигаз и деструкции молекул титина. Решение задачи выявления триггерных механизмов, регулирующих на ранних этапах функциональной разгрузки активирование убиквитин-протеасомной системы и регуляции экспрессии гена титина, может существенно расширить представление о фундаментальных механизмах развития атрофических процессов в мышце. В рамках проекта будут получены фундаментальные результаты, которые позволят приблизиться к наиболее полному и комплексному пониманию механизмов перестройки структуры и метаболизма постуральных мышц в условиях разгрузки, что поможет разработать подходы фармакологической коррекции мышечных дисфункций.

Skeletal muscles have a high degree of plasticity and are able to respond to the unloading (caused by immobilization, microgravity, prolonged bed rest regime, or nerve damage, etc.), atrophy (muscle loss) and atony (reduced stiffness properties). Unloading caused atrophy is determined by decrease in protein synthesis and a dramatic increase in protein degradation (Glass D.J., 2003, Bodine S., 2014, Kandarian S. et al., 2004), resulting in a reduced content of contractile and cytoskeletal proteins. For postural muscles (e.g. soleus muscle), which are most susceptible to atrophic processes, the contribution of the ubiquitinproteasomal system in the degradation of proteins is especially great, because of it responsible for 80-90% of turnover of cytoplasmic proteins available for proteolysis (Cohen S. et al., 2009). The development of the described phenomena is caused by changes in the expression of key proteins: E3 ubiquitin ligases determining the intensity of the proteasomal pathway of protein degradation, as well as titin modifications. Titin (connectin) – the giant elastic muscle protein responsible for maintaining the structure and biomechanical properties of muscles, and also playing an important role in the processes of intracellular signaling. Elastic properties of the titin molecules determine the stiffness of muscle fibers that directly affects their tone. The aim of our study is to identify the trigger mechanisms regulating gene expression of major muscle E3-ubiquitin ligases (atrogin-1 and MuRF-1) and giant protein of the sarcomere cytoskeleton in early stages of skeletal muscles unloading. It was shown recently that proteins MuRF-1 and MuRF-2 sit on titin (Labeit S. et al., 2002) and detach from it due to muscles unloading when titin’s spring is tensioned. It is also known that the myosin heavy chains which occupy about 70% of muscle fibers, are substrates of these E3-ligases. That is why we are interested to investigate the early stages of functional unloading to catch the beginning of this process. One of the fundamental tasks in the framework of this problem is 1) the study of the role of histone deacetylases (HDAC1,HDAC 4/5) in muscle functional unloading-induced activation of transcription factors FOXO and myogenin during atrogin-1 and MuRF-1 gene expression. Identifying the mechanisms controlling the degradation of muscle proteins during unloading, we will be able to develop a mode of pharmacological correction of atrophic processes in the muscle. Next important objective of the project is: 2) study the regulation of titin gene expression (titin plays a significant role in the development of muscle atony) in functional unloading. In skeletal muscle of mammals and humans expressed N2A-isoforms 3.3– 3.7 MDa, generated from alternative splicing (Bang et al., 2001). It was shown recently that RNA-binding protein Rbm20 regulates alternative splicing and expression of N2BA isoform of titin isovariants and N2B in cardiac muscle (Li Shijun et al., 2013). It was also found that the histone deacetylases (HDACs) class IIa participate in reactions with specific transcription factors and increase the transcriptional repressor function in the nucleus of striated and smooth muscle cells (Di Griorgio E., Brancolini C., 2016; Gaur V. et al., 2016). In this project we for the first time propose to investigate the role of Rbm20 and class IIa HDACs in the regulation of alternative splicing and expression of N2BA isoform of titin isovariants in skeletal muscle soleus during modeling of gravitational unloading. We will also investigate for the first time the dynamics of expression of titin’s pre-mRNA and its splicing at different stages of unloading. An important contribution to the study of the problem of regulation of key proteins expression is to identify 3) the effects of muscle tone on the development of atrophic changes and its role in the regulation of leading genes expression which control contractile and cytoskeletal muscle proteins degradation. It is known that muscle tone is reduced during hypokinesia, which can cause atrophy of the muscle due to ubiquitin-proteasomal system activation and the E3 ligases expression. It is possible to artificially increase the muscle tone by tetanus toxin injection in unloaded muscle. We are going to administrate this substance to m.soleus and assume to prevent (or reduce) the basic ubiquitin ligases expression and of titin degradation in 7 days model of unloading. The solution of the problem to identify the trigger mechanisms of ubiquitin-proteasomal system activity regulation and titin gene expression regulation at early stages of functional unloading can significantly expand the understanding of the fundamental mechanisms of the atrophic processes development in the muscle. The project will allow to obtain the fundamental results, which is capable to receive the most complete and integrated understanding the mechanisms of postural muscles structure and metabolism reorganization during unloading. These data will help to develop approaches to pharmacologicalcorrection of muscle dysfunctions.

В фокусе внимания проекта находится исследование регуляции экспрессии ключевых генов скелетной мышцы в условиях функциональной разгрузки. Первый контур – это исследование эпигеномной регуляции, связанной с накоплением дефосфорилированных гистондеацетилаз в ядре. В соответствии с нашими ранее полученными данными, это накопление в ряде случаев обусловлено дефосфорилированием АМФ-активированной протеинкиназы (АМПК) [Vilchinskayaetal., 2017]. Накопление HDAC4 и, возможно, HDAC1, может привести к увеличению экспрессии Е3 убиквитин лигаз (через миогенин-зависимый механизм) [Moresietal., 2010] и блокированию экспрессии титина. Поэтому важным результатом проекта будет получение данных, подтверждающих (или опровергающих) влияние изменения уровня фосфорилирования АМПК на импорт HDAC4 и 1 в ядра на начальном этапе функциональной разгрузки. В рамках проекта предполагается также получить результаты, свидетельствующие о влиянии ядерных HDAC на экспрессию изучаемых генов Е3-лигаз (MuRF-1, atrogen-1, myogenin, титин) в условиях разгрузки. Для этого будут применены селективные ингибиторы каждой из исследуемых HDAC (HDAC1, HDAC4 и HDAC5). Мы также проверим гипотезу, контролирует ли гистондеацетилаза HDAC I работу FOXO3a и экспрессию Е3 лигаз (MuRF-1 и atrogin-1/MAFbx) на раннем этапе функциональной разгрузки мышц. Ингибируя работу HDACI ингибитором CI-994 мы должны определить, влияет ли дезацетилазная активность HDAC I на активацию FoxO и индукцию программы атрофии мышц. Если гипотеза верна, при ингибировании HDACI мы должны обнаружить снижение степени атрофии m.soleus крыс, снижение содержания тотального FOXO3 в ядерной фракции m.soleus, снижение экспрессии генов MuRF-1 и atrogin-1/MAFbx, снижение повышенного протеолиза титина при отсутствии достоверных изменений уровня экспрессии гена этого белка (относительно вышеуказанных параметров группы крыс с вывешиванием без введения препарата). К концу второго года работы мы должны выявить роль HDAC4,5 как возможных регуляторов экспрессии генов Е3 убиквитин лигаз MuRF-1, atrogin-1 и титина. Для этого будет проведено трёхдневное вывешивание крыс (модулирующее функциональную разгрузку мышц) с введением ингибитора HDAC 4/5. HDAC класса II (HDAC4 и HDAC5) способствуют нейрогенной атрофии через их транскрипционную репрессию Dach2, которая обычно действует для подавления миогенин-зависимой индукции генов, связанных с атрофией. Будет измерено содержание белка HDAC 4/5 и pHDAC 4/5, уровень мРНК Dach2, миогенина, титина, MuRF-1 и atrogin-1, уровень Akt/pAkt, FOXO3/pFOXO3. Будет оценен вес m.soleus у вывешенных животных, животных с ингибированием HDAC 4/5 и контрольной группы. Мы должны получить ответ на вопрос, влияют ли HDAC 4/5 на регуляцию уровня Е3 лигаз на ранних сроках разгрузки мышц. Если гипотеза верна, то при их ингибировании мы должны усилить репрессию Dach2, обнаружить меньшее содержание миогенина (мРНК и белка) и снижение экспрессии генов MuRF-1 и atrogin-1. К концу третьего года работы мы выявим влияние мышечного тонуса на развитие атрофических изменений при разгрузке и его роли в регуляции экспрессии ведущих генов, контролирующих деструкцию сократительных и цитоскелетных мышечных белков. Средством искусственного повышения мышечного тонуса является тетанотоксин (столбнячный токсин), действие которого основано на блокировании высвобождения ГАМК и глицина из нервных окончаний путём расщепления синаптобревина (Schiavo et al., 1992). Недавно было показано, что атрофические изменения в m. tibialis anterior крысы после двухнедельной иммобилизации конечности можно предотвратить с помощью введения тетанотоксина (Matthews et al., 2014). Мы собираемся провести 7-суточный эксперимент с введением препарата при функциональной разгрузке мышц крыс в m.soleus. Будет исследован уровень экспрессии HDAC, миогенина, титина, MuRF-1 и atrogin-1, уровень Akt/pAkt, FOXO3/pFOXO3. Мы ожидаем получить предотвращение увеличения экспрессии основных Е3-лигаз, и снижения содержания титина и, таким образом, доказать, что мышечный тонус при разгрузке контролирует работу убиквитин протеасомной системы и регуляцию экспрессии генов ключевых белков мышц. Особое внимание в проекте уделено исследованиям, направленным на выяснение роли РНКсвязывающегося белка Rbm20 в регуляции альтернативного сплайсинга и экспрессии изовариантов N2A-изоформы титина в скелетной мышце soleus при моделировании гравитационной разгрузки, а также в экспериментальных моделях, описанных выше, с применением тетанотоксина и ингибитора гистондеацетилаз. Молекулярные факторы, влияющие на интенсивность экспрессии гена титина в целом, неизвестны. Однако известны факторы, регулирующие альтернативный сплайсинг гена титина, посредством чего изменяется уровень экспрессии более длинных или более коротких изоформ этого белка. Одним из таких факторов является РНК-связывающийся белок Rbm20 (Shijun Li et al., 2013). В рамках данного проекта методом ПЦР в режиме реального времени с использованием набора праймеров (Shijun Li et al., 2013), позволяющих выявлять наличие или отсутствие в мРНК титина экзонов в диапазоне от 50-го до 101-го, кодирующих самый вариабельный из-за альтернативного сплайсинга участок молекулы скелетного титина, расположенный в I-зоне саркомера, будут получены данные об экспрессии изовариантов N2A-изоформы титина в m. soleus крыс контрольных и экспериментальных групп. В мышце soleus контрольных крыс ожидается обнаружить преимущественную экспрессию самого длинного изоварианта N2A-изоформы титина с м.м. 3700 кДа. Однако при этом, возможно, будет обнаружена экспрессия и более коротких изовариантов, мРНК которых не содержит ряд экзонов из вышеперечисленного вариабельного участка. В m. soleus вывешенных крыс ожидается обнаружить уменьшение доли длинных и увеличение доли (а, возможно, и количества) более коротких изовариантов N2A-изоформы титина. Аналогичная серия исследований будет проведена в экспериментах, описанных выше, с применением тетанотоксина и ингибитора гистондеацетилаз. С помощью разработанной нами методики высокоразрешающего ДСН-гель-электрофореза (Vikhlyantsev, Podlubnaya, Biophys Rev, 2017) и Вестерн-блоттинга будут исследованы изменения содержания и уровня фосфорилирования титина в m. soleus крыс при использовании всех описанных выше моделей. Подобные исследования проводились нами ранее, однако их проведение в рамках новых экспериментов необходимо для наилучшего анализа и понимания полученных результатов. Кроме того, принимая во внимание вероятность появления в m. soleus вывешенных крыс более коротких изовариантов N2A-титина (не обнаруженных никем ранее), мы попытаемся зарегистрировать их, используя разработанный нами метод ДСН-гель-электрофореза. Подобная задача поставлена впервые. Одна из задач проекта будет заключаться в исследовании методом Вестерн-блоттинга изменений содержания Rbm20 (регулирует альтернативный сплайсинг и экспрессию гена титине) в ядерной и цитоплазматической фракциях m. soleus контрольных и опытных крыс. Ожидается обнаружить увеличение содержания Rbm20 в ядерной фракции и уменьшение его содержания в цитоплазматической фракции m. soleus крыс после 3-х и 7-суточного моделирования гравитационной разгрузки. Противоположную направленность изменений содержания Rbm20 в ядерной и цитоплазматической фракциях в m. Soleus крыс ожидается обнаружить в модельных экспериментах с применением тетанотоксина и ингибитора гистондеацетилаз. Несомненно, что исследование регуляции экспрессии ключевых генов скелетной мышцы в условиях функциональной разгрузки, является важной фундаментальной задачей, имеющей в ближайшей перспективе большое практическое значение. Результаты исследования позволят приблизиться к наиболее полному и комплексному пониманию механизмов перестройки структуры и метаболизма постуральной мышцы в условиях разгрузки, что в свою очередь, позволит разработать подходы коррекции и лечения мышечных дисфункций. Следует также отметить, что запланированные в исследования задачи поставлены впервые, полученные результаты будут иметь важное фундаментальное и прикладное значение и будут соответствовать мировому уровню исследований в данной области науки.

В течение ряда лет коллектив занимался исследованием внутриклеточной сигнализации, физиологией мышечной деятельности и биохимией скелетных мышц (человека и животных) при их повышенной и пониженной физической активности. Впервые было показано, что: - регуляция уровня мРНК Е3-убиквитин лигаз MuRF1 и MAFbx в скелетных мышцах не связана с работой L-кальциевых каналов. - кальций является сигнальной молекулой, способной активизировать работу протеолитических ферментов в скелетных мышцах при гипокинезии, а также активировать некоторые транскрипционные факторы тяжелых цепей миозинов;- регуляция активности µ-кальпаина при разгрузке m. soleus связана с модуляцией работы L-кальциевых каналов, а разрушение цитоскелетного белка десмина происходит до начала процесса атрофии мышцы и ассоциировано с аутолизом µ-кальпаина. - ингибирование работы NF-kB сигнального пути на раннем этапе функциональной разгрузки мышц приводит к усилению экспрессии геноа Е3-убиквитин лигаз MuRF-1 и MAFbx и не предотвращает развитие атрофии m.soleus; - Ингибирование протеасом при функциональной разгрузке m.soleus предотвращает увеличение экспрессии в ней Е3-лигаз MuRF-1 и MAFbx, увеличение убиквитинирования белков и содержания кальпаина-1 и не влияет на содержание pAkt, pP90RSK, p-P70S6k, pGSK и p-4E-BP. Таким образом, ингибирование протеасом не затрагивает анаболический сигналинг и снижает активность компонентов катаболических сигнальных путей, чего оказывается недостаточно для предотвращения атрофии в скелетной мышце. - мы смогли выработать способ модулирования содержания Hsp90 в скелетных мышцах при их разгрузке (методом ингибирования HSF-1) и выявить функцию Hsp90/70 в работе убиквитинпротеасомного сигнального пути За последние несколько лет получено 7 патентов применения препаратов, имеющих протекторное действие на белки скелетных мышц при различных повреждающих воздействиях.

Для выявления роли гистондеацетилазы 1 (HDAC1) в активации транскрипционных факторов FOXO и миогенина и экспрессии генов MAFbx/atrogin-1,MuRF-1 и титинапри функциональной разгрузке мышц планируется ингибировать HDAC1 в течение трех дней с помощью введения его высокоспецифичного ингибитора CI-994 (Seki M., 2016). Способы и дозы введения этого ингибитора хорошо изучены,показаны эффекты этого ингибитора в работах на грызунах, собаках, препарат хорошо проникает в клетки. Известно, что максимум экспрессии Е3-лигаз atrogin-1/MAFbx и MURF1 достигается уже на третьи сутки вывешивания, в связи с этим и выбрана продолжительность эксперимента – трое суток.Одна группа крыс линии Wistar будет служить контролем (n=14), вторая будет подвергаться вывешиванию (n=14, описание вывешивания см. выше) и третья группа будет вывешена по методике Ильина Новикова в модификации Морей-Холтон (Novikov V.E., Ilyin E.A.,1981) с введением CI-994 (ингибитора HDACI) в концентрации 1,0 мг/кг в сутки внутрибрюшинно (n=14). Увеличение выборки животных до 14 определяется необходимостью большего количества биоматериала для реализации применяемых подходов и методик, а также работой с материалом эксперимента в 2х лабораториях (работы с титином). Методом ПЦР в режиме реального времени планируется исследовать роль гистондеацетилазы 1 (HDAC1) и ее ингибирования на экспрессию гена титина. Для этого будут использованы праймеры (Shijun Li et al., 2013), позволяющие выявлять наличие или отсутствие в мРНК титина экзонов в диапазоне от 50-го до 101-го, кодирующих самый вариабельный из-за альтернативного сплайсинга участок молекулы скелетного титина, расположенный в I-зоне саркомера. С помощью Вестерн-блоттинга и разработанного нами метода ДСН-электрофореза в крупнопористом геле будут исследованы изменения в содержании, количестве изовариантов N2A-изоформы титина, а также изменения уровня фосфорилирования этого белка в m. soleus контрольных и вывешенных крыс. Для этого исследования будут применены следующие методы: ПЦР в реальном времени, электрофорез с последующим вестернблотингом, ко-иммунопреципитация, иммугистохимические методы. Животные будут наркотизированы авертином и будет выделена m.soleus. До анализа материал будет храниться в холодильнике при -80Со. Мы ожидаем получить ответ на вопрос, участвует ли HDAC1 в активации транскрипционных факторов FOXO и миогенина, а также экспрессии Е3-лигаз MAFbx/atrogin-1,MuRF-1и титина при функциональной разгрузке мышц. Мы надеемся обнаружить снижение степени атрофии m.soleus в результате ингибирования HDAC1, снижение уровня убиквитинирования белков, снижение деструкции титина.Методы исследования: форез, вестерн-блот, РТ-ПЦР, ко-имунопреципитация. Срок проведения эксперимента – 2018 год.