|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Молекулярные механизмы и физиологическая роль невезикулярного транспорта стеринов между плазматической мембраной и внутриклеточными компартментами дрожжей Saccharomyces cerevisiaeНИР
Molecular mechanisms and the physiological role of non-vesicular transport of sterols between the plasma membrane and intracellular compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae
- Руководитель НИР: Северин Ф.Ф.
- Ответственные исполнители: Галкина К.В., Зырина А.Н., Соколов С.С.
- Участники НИР: Киреева Н.А.
- Подразделение: Лаборатория фотохимии биомембран
- Срок исполнения: 20 апреля 2018 г. - 15 декабря 2022 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 18-14-00151
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Структура и функция биологических мембран. Биоэнергетика. Фотосинтез.
-
Рубрики ГРНТИ:
- 34.15.01 Общие вопросы
- 34.15.35 Молекулярная мембранология
-
Ключевые слова:
плазматическая мембрана, эргостерол, транспорт стеролов, устойчивость к стрессу, дрожжи, стеролы, lam белки, saccharomyces cerevisiae
ergosterol, yeast, sterols, sterol transport, lam proteins, resistance to stress, saccharomyces cerevisiae, plasma membrane -
Описание:
Стерины играют ключевую роль в регуляции физико-химических свойств плазматической мембраны клеток эукариот. Невезикулярный транспорт стеринов между плазматической мембраной и эндоплазматическим ретикулумом критически важен для жизнедеятельности клеток, но его молекулярные механизмы и регуляция до сих пор не ясны. Наша группа охарактеризовала гены YSP1 (LAM1) и YSP2 (LAM2) и показала, что нарушение их работы повышает устойчивость дрожжей к некоторым стрессам. Недавно группой Тима Левайна (T. Levine, UK) было обнаружено, что Lam белки выполняют функцию невезикулярного транспорта стеринов между мембранами и локализованы в межмембранных контактах. LAM гены найдены у большинства эукариотических организмов, включая человека, они кодируют белки, которые содержат трансмембранный и эргостерин-связывающий домены. Данный проект направлен на всестороннее изучение Lam белков на удобном модельном объекте — дрожжах Saccharomyces cerevisiae. В результате выполнения проекта будут найдены и охарактеризованы генетические взаимодействия LAM генов (геном дрожжей содержит 6 LAM генов) и физические взаимодействия закодированных ими белков. Будут определены физиологические последствия нарушения и сверхэкспрессии LAM генов, в частности изменения резистентности к высокой концентрации разных солей. Мы определим как в штаммах с делецией либо гиперактивацией LAM генов меняется содержание стеринов в плазматической мембране. Мы также оценим, как аналогичные изменения содержания стеринов в искусственных мембранах влияют на их стабильность и проницаемость для воды. Эти подходы позволит смоделировать и систематически изучить проявления дисбаланса стеринов в клетке, а также сравнить влияние этого дисбаланса на барьерную функцию фосфолипидного бислоя и на физиологию клеток. Представленный проект является важным звеном в раскрытии молекулярных механизмов невезикулярного транспорта стеринов, которое необходимо для понимания круговорота стеринов в клетке. Ввиду высокой консервативности механизмов транспорта стеринов среди эукариот, полученные в ходе реализации этого проекта данные могут открыть новые подходы к лечению заболеваний, связанных с нарушением метаболизма и транспорта стеринов у человека.
-
Abstract:
Sterols play a key role in the regulation of the physico-chemical properties of the plasma membrane of eukaryotic cells. The non-vesicular transport of sterols between the plasma membrane and the endoplasmic reticulum is crucially important for cells, but its molecular mechanisms and regulation are still unclear. Our group characterized the genes YSP1 (LAM1) and YSP2 (LAM2) and showed that disruption of their work increases the resistance of yeast to some stresses. Recently, a group of Tim Levine (UK) found that Lam proteins act as a non-vesicular transporters of sterols between membranes and are localized in the intermembrane contacts. LAM genes are found in most eukaryotic organisms, including humans, they encode proteins that contain transmembrane and ergosterol-binding domains. This project is aimed at a comprehensive study of Lam proteins using an instrumental model organism - the yeast Saccharomyces cerevisiae. As a result of the project, the genetic interactions of the LAM genes ( yeast genome contains 6 LAM genes) and the physical interactions of the proteins encoded by them will be found and characterized. Physiological consequences of disruption and overexpression of LAM genes, in particular, changes in resistance to a high concentration of different salts, will be determined. We will determine how the content of sterols in the plasma membrane changes in the strains with the deletion or hyperactivation of the LAM genes. We will also assess how similar changes in the content of sterols in artificial membranes affect their stability and permeability to water. These approaches will allow to simulate and systematically examine the manifestations of sterol imbalance in the cell, and also to compare the effect of this imbalance on the barrier function of the phospholipid bilayer and on the physiology of the cells.The presented project is an important link in revealing the full picture of the molecular mechanisms of the non-vesicular transport of sterols, which is necessary for understanding the trafficking of sterols in a cell. Due to the high conservatism of the transport mechanisms of sterols among eukaryotes, the data obtained during the implementation of this project may open up new approaches to the treatment of diseases linked to sterol transport and metabolism in humans.
- Добавил в систему: Северин Федор Федорович
Источник финансирования НИР
| грант РНФ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 20 апреля 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Молекулярные механизмы и физиологическая роль невезикулярного транспорта стеринов между плазматической мембраной и внутриклеточными компартментами дрожжей Saccharomyces cerevisiae |
| Результаты этапа: 1. В ходе выполнения проекта были сконструированы более 40 штаммов. Все штаммы были получены путем трансформации родительского штамма кассетой генов, содержащей модифицированную последовательность дрожжевого генома и последовательность маркерного гена. Правильность интеграций подтверждена ПЦР с проверочными праймерами. 2. Было показано, что lam мутанты, включая одиночный мутант lam2, более чувствительны к серии из чередований замораживаний-оттаиваний и тепловому стрессу 45С, чем дикий тип, причем степень чувствительность возрастала по мере увеличения числа делеций lam генов. 3. Было показано, что штаммы lam2lam4 и lam1lam2lam3lam4 в отличее от дикого типа и lam1l1m3 оказались неспособны расти в богатой среде (YPD), в которую был добавлен этанол (конечная концентрация 8 объемных %). С другой стороны — для роста в присутствие 5% пропанола было достаточно присутствия любой из двух пар паралогичных генов. Это говорит о частичной функциональной заменяемости генов не только внутри пар, но и между пар LAM2/LAM4 и LAM1/LAM3 4. Мы обнаружили пониженную резистентность lam1lam2lam3lam4 штамма к высокой (токсичной) концентрации NaCl в среде. Этот эффект наблюдался как на сбраживаемом (YPD), так и на слабосбраживаемом субстрате (с галактозой). Штамм со сверхэкспрессией LAM2 (PGAL-LAM2) напротив проявлял повышенную устойчивость к высоким концентрациям NaCl. 5. Было показано, что наблюдаемая нами при сверхэкспрессии LAM2 повышенная, а при нарушении совместном нарушении LAM генов пониженная устойчивость клеток S. cerevisiae к гиперосмотическому стрессу не является следствием изменения активации основного пути ответа на гиперосмотический стресс Hog-каскада. 6. На искусственных мембранах было показано, что повышенная концентрация NaCl (1М, условия осмотического стресса клеток дрожжей) ухудшает барьерную функцию модельной мембраны. Повышенная концентрация эргостерина способствовала сохранению барьерной функции. 7. Было показано, что ни нарушение lam1lam2lam3lam4, ни сверхэкспрессия LAM2 не приводит к изменению общего содержания стеринов в клетках. При этом содержание стеринов в плазматической мембране lam1lam2lam3lam4 выше, чем у дикого типа. 8. Мы обнаружили, что функция всех четырех LAM генов вырождена по отношению к некоторым стрессам. Было показано взаимодействие LAM2 гена c геном ERG5. Делеция ERG5 увеличивала резистентность дрожжей к амиодарону, однако делеция LAM2 гена отменяла этот эффект. Было показано, что нарушения LAM генов не приводят к изменению уровня экспрессии основного Osh белка Osh4p 9. Было показано, что нарушения LAM генов не приводят к изменению чувствительности клеток к цитотоксическим концентрациям азольных антимикотиков (Кетоконазол 50 мкг/мл, Клотримазол 35 мкг/мл, Миконазол 20 мкг/мл, Флуконазол 50 мкг/мл. Инкубация 3 часа при 30°С) при этом более устойчивы к цитостатическим концентрациям клотримазола 8 мкг/мл. Сравнение чувствительности lam мутантов с диким типом к амфотерицину действующему через связываение с эргостерином плазматической мембраны выявило повышенную чувствительность lam мутантов. Причем и к цитостатическим 1.6мкг/мл и к цитотоксическим 1.45мг/мл концентрациям амфотерицина В. Основной вклад в чувствительность к амфотерицину В вносит нарушение lam2 гена. Сверхэкспрессия LAM2, напротив, повышала устойчивость к амфотерицину В. | ||
| 2 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Молекулярные механизмы и физиологическая роль невезикулярного транспорта стеринов между плазматической мембраной и внутриклеточными компартментами дрожжей Saccharomyces cerevisiae |
| Результаты этапа: | ||
| 3 | 1 февраля 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Молекулярные механизмы и физиологическая роль невезикулярного транспорта стеринов между плазматической мембраной и внутриклеточными компартментами дрожжей Saccharomyces cerevisiae |
| Результаты этапа: | ||
| 4 | 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Молекулярные механизмы и физиологическая роль невезикулярного транспорта стеринов между плазматической мембраной и внутриклеточными компартментами дрожжей Saccharomyces cerevisiae |
| Результаты этапа: | ||
| 5 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Молекулярные механизмы и физиологическая роль невезикулярного транспорта стеринов между плазматической мембраной и внутриклеточными компартментами дрожжей Saccharomyces cerevisiae |
| Результаты этапа: | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".