Новые фотосенсибилизаторы на основе амфифильных фталоцианинов и их металлокомплексов для фотодинамической терапии ракаНИР

New photosensitizers based on amphiphilic phthalocyanines and their metal complexes for photodynamic therapy of cancer

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 июля 2018 г.-30 июня 2019 г. Новые фотосенсибилизаторы на основе амфифильных фталоцианинов и их металлокомплексов для фотодинамической терапии рака
Результаты этапа: В настоящее время фотодинамическая терапия (ФДТ) является общепринятым методом лечения различных типов рака, включая рак кожи и рак легких, а также для противовирусных и антибактериальных применений. Эффективность ФДТ основана на взаимодействии трех компонентов: фотосенсибилизатора, света и молекулярного кислорода. После внутривенной инъекции и накопления фотосенсибилизатора в злокачественной ткани фототерапевтический эффект активируется облучением светом для генерации высокореактивного синглетного кислорода из легко доступного триплетного кислорода в клетках. Эти активные формы кислорода вызывают токсическую реакцию в злокачественной ткани, что в конечном итоге приводит к гибели клеток. Одной из основных проблем в ФДТ является разработка селективных фотосенсибилизаторов, которые могут преимущественно накапливаться в злокачественных тканях по сравнению с нормальными тканями. Хотя уровень селективности может быть достигнут при ограниченном освещении целевой области, использование селективных фотосенсибилизаторов, которые могут значительно уменьшить побочные эффекты и улучшить терапевтические результаты, все еще необходимо. Среди известных фотосенсибилизаторов особое место занимают фталоцианины, благодаря их сильному и длинноволновому поглощению, высокой эффективности при генерировании активных форм кислорода (АФК) и простоте химической модификации. Фталоцианины стали перспективным классом фотосенсибилизаторов второго поколения для фотодинамической терапии. За последнее десятилетие было получено и оценено значительное количество фотосенсибилизаторов на основе фталоцианинов на их фотодинамическую активность, с акцентом на аналоги кремния, цинка и алюминия в результате их желательных фотофизических свойств. Однако одной значительной проблемой фотосенсибилизаторов (ФС) на основе фталоцианина является плохая растворимость их гидрофобного скелета в физиологических средах. Поэтому научное внимание было сосредоточено на разработке водорастворимых ПС. Создание амфифильных фотосенсибилизаторов путем сочетания гидрофобных макроциклов с гидрофильными углеводными группами привлекло большое внимание, главным образом из-за того факта, что некоторые углеводы имеют специфическое распознавание раковых клеток. В дополнение к этим биомолекулам углеводы также являются многообещающими кандидатами для биоконъюгирования с фотосенсибилизаторами для достижения целевого ФДТ. Давно известно, что раковые клетки имеют повышенный уровень поглощения глюкозы и гликолиза, чтобы обеспечить достаточную метаболическую энергию для поддержания их пролиферации. Транспорт глюкозы через клеточную мембрану опосредуется белками-переносчиками глюкозы, которые сверхэкспрессируются в различных карциномах человека. Используя это преимущество, проводят гликоконъюгирование различных фотосенсибилизаторов, таких как порфирины, хлорины, с целью повышения их клеточного поглощения и, в конечном итоге, эффективности ФДТ. В отличие от углеводно-порфириновых конъюгатов, гликоконъюгированные фталоцианины чрезвычайно редки, несмотря на их большой потенциал в ФДТ. В ходе первого этапа по гранту РНФ «Новые фотосенсибилизаторы на основе амфифильных фталоцианинов и их металлокомплексов для фотодинамической терапии рака» нами был осуществлен синтез гликоконъюгатов фталонитрила с различными углеводами такими как рибоза, галактоза, манноза и глюкоза. При этом в качестве линкеров соединиящих два фрагмента были выбраны алкоксильный, триазольный, полифторфенильный и аллильный соответственно. Для получения соответствующих гликозилированных фталонитрилов на первом этапе нами были синтезированы производные с необходимыми спейсерными группами для конъюгирования. В качестве исходного соединения для получения различных фталонитрилов со спейсерными группами был выбран и синтезирован 4-нитрофталонитрил с использованием трехстадийного подхода из коммерчески доступного фталимида. На первой стадии был получен 4-нитрофталимид через реакцию нитрования дымящей азотной кислотой в концентрированной серной кислоте с выходом 80%. Затем в результате взаимодействия с 30% раствором аммиака в воде было раскрыт фталимидный цикл с образованием амида 4-нитрофталевой кислоты с выходом 75%. На заключительной стадии с использованием реакции дегидратации амида 4-нитрофталевой кислоты с тионил хлоридом в N,N-диметилформамиде был получен 4-нитрофталонитрил с 90% выходом. Следует отметить, что мы успешно модифицировали описанную в литературе методику получения 4-нитрофталонитрила изменив температурный режим реакции и порядок добавления реагентов, что позволило значительно поднять общий выход желаемого продукта. Для создания гликоконъюгатов с алкоксиметильным, триазольным, полифторфенильным и аллильным линкерами на первом этапе было необходимо получить соответствующие 4-замещенные фталонитрилы содержащие необходимые функциональные группы для последующей сшивки. Таким образом, нами были выбраны следующие фталонитрилы, а именно 4-пропаргилокси-замещенный фталонитрил, 4-аллилокси-замещенный фталонитрил, 4-(пентафторфенокси)фталонитрил и 4-(1-п-толуолсульфонил-2-гидроксиэтил)-замещенный фталонитрил. Вышеупомянутые фталонитрилы были синтезированы с использованием реакции 4-нитрофталонитрила с соответствующими спиртами. 4-Пропаргилокси-замещенный фталонитрил получен через реакцию нуклеофильного замещения 4-нитрофталонитрила с пропаргиловым спиртом. Синтез проводили при комнатной температуре в N,N-диметилформамиде в присутствии безводного карбоната калия в качестве основания. Нами была оптимизирована методика выделения основанная на высаждении продукта ледяной 3М соляной кислотой, что позволило сократить потери и повысить выход до 95%. 4-Аллилокси-замещенный фталонитрил синтезирован через реакцию нуклеофильного замещения 4-нитрофталонитрила с аллиловым спиртом. Синтез проводили при комнатной температуре в N,N-диметилформамиде в присутствии безводного карбоната калия в качестве основания. Нами была оптимизирована методика выделения основанная на высаждении продукта ледяной 3М соляной кислотой, что позволило сократить потери и повысить выход до 90%. 4-(Пентафторфенилокси)-замещенный фталонитрил получен через реакцию нуклеофильного замещения 4-нитрофталонитрила с пентафторфенолом. В отличие от реакций с участием алифатических спиртов (пропаргилового и аллилового) данный процесс проводили при нагревании в N,N-диметилформамиде в течение 48 часов. Поскольку описанная в литературе методика получения данного соединения не приводила к образованию продукта с хорошими выходами, разработанная нами процедура является наиболее эффективной в настоящее время. 4-(1-п-толуолсульфонил-2-гидроксиэтил)-замещенный фталонитрил синтезирован в результате взаимодействия 4-нирофталонитрила с 1-п-толуолсульфонил-2-гидроксиэтанолом в присутствии гидрида натрия в качестве основания в абсолютном тетрагидрофуране. Исходный 1-п-толуолсульфонил-2-гидроксиэтанол был получен при взаимодействии 1,2-этиленгликоля с п-толуолсульфонил хлоридом при сильном разбавлении в дихлорметане, чтобы минимизировать образование побочного 1,2-продукта. Все полученные фталонитрилы были полностью охарактеризованы с помощью ЯМР-спектроскопии, ИК-спектроскопии, масс-спектрометрии. После успешного синтеза исходных фталонитрилов нами была проведена работа по получению углеводов с необходимыми функциональными группами. Для этого нами были выбраны перацетильные производные галактозы, глюкозы, маннозы и рибозы, которые являются легко доступными соединениями. Таким образом нами были синтезированы перацетильные производные галактозы, глюкозы и маннозы в виде чистых β-аномеров через реакцию углеводов с уксусным ангидридом в присутствии безводного ацетата натрия без растворителя. Продемонстрировано, что данный метод позволяет получать желаемые продукты с высокими выходами без образования побочного α-аномера и использования колоночной хроматографии для выделения целевых соединений. Для получения гликоконъюгатов фталонитрилов с углеводами с триазольным линкером были выбраны и синтезированы 1-азидные производные тетраацетатов галактозы, глюкозы и маннозы при взаимодействии перацетатов с триметилсилилазидом и 1-азидоэтанолом в присутствии эфира трифторида бора в качестве катализатора - кислоты Льюиса. Исходный 1-азидоэтанол был получен через реакцию коммерчески доступного 1-хлорэтанола с азидом натрия. Реакции протекали гладко в мягких условиях с образованием желаемых β-аномеров. В случае с рибозой были выбраны в качестве исходных соединений легко доступные 1-ацетокси-2,3,5-три-бензоат- и 5-п-толуолсульфонил-2,3-изопропилиден- β-D рибофуранозы. 1-ацетокси-2,3,5-три-бензоат-β-D-рибофураноза получена с использованием трехстадийного подхода из легко доступной рибозы. На первой стадии была получена 1-метокси-β-D-рибофураноза при взаимодействии рибозы с метиловым спиртом и в присутствии каталитического количества концентрированной кислоты. Следует отметить, что данная реакции протекает исключительно по положению С1, не затрагивая при этом другие свободные гидроксильные группы. Затем нами была проведена постановка защитных бензоильных групп по положениям С2, С3 и С5 при взаимодействии 1-метокси-β-D-рибофуранозы с бензоил хлоридом в присутствии триэтиламина как основания. На последней стадии была проведена реакция замещения 1-метоксигруппы на ацетильную в результате обработки 1-метокси-2,3,5-три-бензоата-β-D-рибофуранозы уксусным ангидридом в абсолютном пиридине. Для получения азидных производных рибозы была выбрана реакция триметилсилилазида или азида натрия с производными углевода содержащими легко уходящие группы, такие как п-толуолсульфоновая и ацетильная. 1-Азидо-2,3,5-три-бензоат-β-D-рибофураноза получена с использованием реакции 1-ацетокси-2,3,5-три-бензоат-β-D-рибофуранозы с триметилсилилазидом в присутствии эфирата трифторида бора. В свою очередь 5-азидо-2,3-О-изопропилиден-β-D-рибофураноза синтезирована с использованием четырехстадийного подхода из коммерчески доступной рибозы. На первой стадии нами была произведена постановка изопропилиденовой защитной группы в результате реакции рибозы с ацетоном и метиловом спиртом в присутствии концентрированной серной кислоты в качестве катализатора. На следующем этапе была 5-п-толуолсульфонил-2,3-О-изопропилиден-β-D-рибофураноза в результате взаимодействия 1-метокси-2,3-О-изопропилиден-β-D-рибофуранозы с п-толуолсульфонил хлоридом в присутствии триэтиламина. На заключительной стадии п-толуолсульфонильная группа была замещена на азидную через реакцию 5-толуолсульфонил-2,3-О-изопропилиден-β-D-рибофуранозы с азидом натрия при нагревании в N,N-диметилформамиде, что привело к образованию целевого продукта с общим выходом 60%. После успешного синтеза фталонитрилов и углеводов с необходимыми функциональными группами нами была проведена работа по проведению и оптимизации условий реакций образования гликоконъюгатов. Для получению конъюгатов с алкоксильным линкером нами была выбрана реакция гликозилирования перацетатов углеводов таких галактоза, глюкоза и манноза. Таким образом синтезированы гликоконъюгаты фталонитрила с галактозой, глюкозой и маннозой с алкоксиметильным линкером с использованием реакции гликозилирования между 4-(1-п-толуолсульфонил-2-гидроксиэтил)-замещенным фталонитрилом и перацетильными производными углеводов. Для синтеза гликозилированных фталонитрилов с полифторфенильным линкером было использована реакция нуклеофильного замещения фтора в пентафторфенильном фрагменте при взаимодействии с перацетатами углеводов. Таким образом синтезированы гликоконъюгаты фталонитрила с галактозой, глюкозой и маннозой с полифторфенильным линкером с использованием реакции гликозилирования между 4-(пентафторфенилокси)-замещенным фталонитрилом и перацетильными производными углеводов. Следующим этапом было получение конъюгатов фталонитрила с углеводами с триазольным линкером. Гликоконъюгаты фталонитрила с галактозой, глюкозой, маннозой и рибозой с триазольным линкером были синтезированы с использованием медь(I)-катализируемой клик-реакции между 4-пропаргилокси-замещенным фталонитрилом и азидными производными углеводом. Следует отметить, что данная реакция протекает высоко региоселективно и приводит к образованию исключительно только 1,4-изомера 1,2,3-триазольного цикла. Следует отметить, что в случае 4-аллилокси-замещенного фталонитрила напрямую невозможно получить соотвествующий фталоцианин, поскольку из-за жестких условий синтеза происходит изомеризация двойной связи. Поэтому нами была выбрана альтернативная методология, основанная на получении гликоконъюгата через модификацию уже полученного фталоцианина содержащего двойные связи. В рамках первого этапа гранта РНФ был осуществлен синтез комплексов цинка(II), палладия(II), платины(II) с тетра-аллилокси-замещенным фталоцианином через тетрамеризацию 4-аллилокси-замещенного фталонитрила. Все полученные соединения полностью охарактеризованы с использованием физико-химических методов анализа таких как ЯМР-спектроскопия, ИК-спектроскопия, масс-спектрометрия, термогравиметрия и элементный анализ. Таким образом в рамках первого этапа синтезированы гликозилированные фталонитрилы с алкоксильным, полифторфенильным, триазольным и аллильным линкерами, которые являются прекурсорами для получения фталоцианинов – фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии рака нового поколения.
2 1 июля 2019 г.-30 июня 2020 г. Новые фотосенсибилизаторы на основе амфифильных фталоцианинов и их металлокомплексов для фотодинамической терапии рака
Результаты этапа: В ходе второго этапа по гранту РНФ «Новые фотосенсибилизаторы на основе амфифильных фталоцианинов и их металлокомплексов для фотодинамической терапии рака» нами был осуществлен синтез фталоцианинов и металлокомплексов на их основе, содержащих в своем составе фрагменты углеводов, таких галактоза, манноза, глюкоза и рибоза. В качестве соединительных линкеров были выбраны 1,2,3-триазольный, алкоксильный и аллильный, поскольку они обладают достаточной гибкостью и формируют единую сопряженную систему между макроциклом и углеводом. На первом этапе были синтезированы металлокомплексы тетра-замещенных гликозилированных фталоцианинов с индием(III), галлием(III), палладием(II) и платиной(II). Выбор центрального иона металла в комплексах гликоконъюгатов обусловлен, тем что их природа и геометрия полученных комплексов достаточно сильно влияет на фотофизические параметры такие как время жизни фосфоресценции или триплетного состояния и квантового выхода генерации синглетного кислорода. Для получения тетра-замещенных гликозилированных фталоцианинов были разработаны две синтетические стратегии: конъюгирование фталоцианинов с углеводами, содержащими спейсерные группы и темплатный синтез с использованием гликофталонитрилов. Следует отметить, что первый подход оказался неудачным, поскольку тетра-замещенные фталоцианины, содержащие в своем составе аллильную, гидроксильную и пропаргильную группы обладают низкой растворимостью и при конъюгировании с углеводами приводили к образованию целевых продуктов в следовых количествах. В связи с этим был сделан выбор в пользу второй синтетической схемы для получения конъюгатов металлокомплексов фталоцианинов с углеводами. Мы использовали темплатный метод синтеза металлокомплексов гликозилированных фталоцианинов из соответствующих фталонитрилов, которые были получены в рамках первого этапа гранта РНФ «Новые фотосенсибилизаторы на основе амфифильных фталоцианинов и их металлокомплексов для фотодинамической терапии рака». Следует отметить, что для сборки макроцикла по данной схеме необходимо использование соли металла, поскольку на первой стадии происходит координация с азотами фталонитрильных групп. Большим преимуществом данного метода является получение металлокомплексов фталоцианинов напрямую из фталонитрилов с высокими выходами и без образования большого количества побочных продуктов. Нами была проведена оптимизация условий синтеза и найдено, что реакция протекает с образованием продуктов с наилучшими выходами при нагревании гликофталонитрила в абсолютном бензонитриле в атмосфере инертного газа (аргона) с использованием соответствующей соли металла (InCl3, GaCl3, PdCl2, PtCl2) и 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена в качестве основания. Контроль реакции осуществляли с помощью тонкослойной хроматографии (силикагель, дихлорметан-метанол (5:1)) и электронной спектроскопии в ультрафиолетовой и видимой областях. После завершения реакции целевые продукты выделяли с помощью колоночной хроматографии (силикагель, дихлорметан-метанол (5:1)) для отделения от исходного фталонитрила и соли металла. После успешного синтеза конъюгатов фталоцианинов с углеводами была проведена реакция снятия защитных ацетильных групп с гексоз, а именно галактозы, глюкозы, маннозы и изопропилиденового остатка в случае β-D-рибофуранозы для определения их влияния на фотофизические параметры,а именно время жизни фосфоресценции или триплетного состояния и квантового выхода генерации синглетного кислорода. Следующим этапом научно-исследовательской работы являлось создание гликоконъюгатов на основе фталоцианинов А3В-типа, содержащих один фрагмент углевода в своем составе. Для получения гликозилированных фталоцианинов такого типа была использована темплатная смешанная конденсация гликофталонитрилов и трет-бутилфталонитрила при нагревании в бензонитриле в атмосфере инертного газа (аргона). Экспериментальным путем было найдено, что оптимальным соотношением реагентов является 1:8 для получения металлокомплексов гликоконъюгатов с высокими выходами (30-40%). Следует отметить, что выходы реакции не удалось поднять, поскольку данный метод является статистическим и наряду с целевым соединением образуются дизамещенный А2В2 и тетразамещенный А4В металлофталоцианины. Контроль реакции осуществляли с помощью тонкослойной хроматографии (силикагель, дихлорметан-метанол (9:1)) и электронной спектроскопии в ультрафиолетовой и видимой областях. После завершения реакции целевые продукты выделяли с помощью колоночной хроматографии (силикагель, дихлорметан-метанол (9:1)) для отделения от побочных продуктов и соли металла. После успешного синтеза конъюгатов фталоцианинов с углеводами была также проведена реакция снятия защитных ацетильных групп с гексоз, а именно галактозы, глюкозы, маннозы и изопропилиденового остатка в случае β-D-рибофуранозы для определения их влияния на фотофизические параметры,а именно время жизни фосфоресценции или триплетного состояния и квантового выхода генерации синглетного кислорода. Все полученные гликозилированные фталоцианины были охарактеризованы с помощью ЯМР-, ИК-спектроскопии, масс-спектрометрии высокого разрешения, электронной спектроскопии в ультрафиолетовой и видимой областях и элементного анализа. После успешного синтеза металлокомплексов гликозилированных фталоцианинов были проведены фотофизические исследования для определения время жизни фосфоресценции и квантового выхода генерации синглетного кислорода. Фосфоресценцию исследуемых соединений измеряли при 77 К в ацетоне на установке с механическим фосфороскопом. Свежеприготовленные растворы металлокомплексов в ацетоне замораживали в специальных металлических рамках толщиной 5 мм в жидком азоте. Образцы в рамках помещали в наполненные жидким азотом кварцевые сосуды Дьюара, закрепленные с помощью специальных держателей внутри фосфороскопа. Фосфоресценцию возбуждали фокусированным светом ксеноновой лампы (1 кВт) через красный граничный светофильтр КС-11 (λ  695 нм). Спектр фосфоресценции измеряли с помощью монохроматора с репликой дифракционной решетки и ширина щели соответствовала 10 нм. Было найдено, что наилучшими показателями обладают металлокомплексы гликозилированных фталоцианинов с палладием(II) и платиной(II) и времена жизни фосфоресценции составили в диапазоне 0.9-1.2 мс. Квантовый выход генерации синглетного кислорода исследуемых соединений определяли относительным методом с помощью химической ловушки. В качестве соединения-стандарта использовали TPP (мезо-тетрафенилпорфин). Согласно литературным данным, наиболее вероятное значение квантового выхода генерации синглетного кислорода этим порфирином в ацетоне составляет 0,65 ± 0,05. В качестве химической ловушки использовали 1,3-дифенилизобензофуран (ДФИБФ). Продукты реакции не имеют полос поглощения в видимом диапазоне спектра. Поэтому о количестве синглетного кислорода, образовавшегося за время фотореакции, можно судить по убыли оптической плотности в области максимума поглощения ДФИБФ. Для определения квантовых выходов генерации синглетного кислорода готовили смешанные растворы исследуемых соединений и ДФИБФ в фиксированном объеме растворителя. Измерения проводили в кварцевых флуоресцентных кюветах с длиной оптического пути 1 см. Растворы облучали определенное время светом, проходящим через монохроматор от ксеноновой лампы флуориметра Perkin Elmer MPF-44B, его мощность измеряли с помощью прибора ThorLabs PM-100D с сенсорной головкой S120VC (Германия). Длина волны света, которым облучались пробы, была подобрана по положению максимума длинноволновой полосы исследуемых соединений. Спектральная ширина щели монохроматора флуориметра соответствовала 5 нм. При облучении контролировали не только изменение оптической плотности в области максимума поглощения ДФИБФ, но и при длине волны возбуждающего света. За время облучения полоса поглощения сенсибилизатора не выцветала, т.е. оптическая плотность сенсибилизатора при длине волны возбуждающего света не изменялась. Оптическую плотность определяли с помощью двулучевого спектрофотометра Hitachi U-3400. Концентрацию ДФИБФ в пробе подбирали так, чтобы его оптическая плотность в области максимума поглощения составляла 0,80-1,20. При расчете квантового выхода относительным методом производили сравнение убыли оптической плотности ДФИБФ и времени облучения в экспериментах, проводимых для исследуемых соединений и соединения-стандарта. С соединением-стандартом проводили три эксперимента, а с исследуемыми соединениями – по четыре. Величины квантовых выходов генерации синглетного кислорода составили 0.4-0.9 и можно сделать вывод о возможном использовании полученных соединений в качестве фотосенсибилизаторов для ФДТ. Поскольку наилучшими фотофизическими характеристиками обладают палладиевые и платиновые комплексы гликозилированных фталоцианинов, то они были выбраны для in vitro исследований на раковых клеточных линиях Tca8113 и белых мышах при внутривенном введении фотосенсибилизатора. были выбраны для in vitro исследований на раковых клеточных линиях Tca8113 и белых мышах при внутривенном введении фотосенсибилизатора.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".