| Результаты этапа: 1. Охарактеризованы механизмы регуляции отдельных ферментов центрального метаболизма путем пост-трансляционной модификации ацетилированием под действием ацетил-КоА in vitro. При действии ацетил-КоА показано ингибирование глутаматдегидрогеназы в условиях ненасыщающей концентрации одного из субстратов, увеличение константы связывания глутаматдегирогеназой ингибитора ГТФ, увеличение амплитуды активации глутаматдегидрогеназы активатором АДФ одновременно с увеличением константы связывания АДФ. В результате суммарный эффект ацетилирования глутаматдегидрогеназы является сложной функцией уровня ацетилирования конкретных остатков лизина и концентрации субстратов и регуляторов фермента. При действии ацетил-КоА также показана активация митохондриальной малатдегидрогеназы в обратной реакции с оксалоацетатом при насыщении субстратов, но не при низкой концентрации оксалоацетата и не в реакции с малатом.
2. Функциональных последствия ацетилирования глутаматдегидрогеназы in vitro и in vivo рассмотрены с учетом структурного анализа сайтов ацетилирования глутаматдегидрогеназы. Определены остатки, ацетилирование которых может влиять на регуляцию (1) взаимодействия субстратов с каталитическим центром (ацетилирование К183), (2) лигандов с аллостерическими центрами (ацетилирование К503 в центре связывания ГТФ и ряда остатков в центре связывания АДФ или в его окружении) и (3) белок-белковых взаимодействий при формировании гетерологических комплексов (ацетилирование К187).
3. Исследование представленности определенных типов ацетилирования глутаматдегидрогеназы в печени, мозге и структурных отделах мозга позволило определить тканеспецифические и гендерные различия в регуляции глутаматдегидрогеназы за счет модификации ацетилированием. В целом, полученные нами результаты свидетельствуют о более выраженном ацетилировании глутаматдегидрогеназы мозга по сравнению с печенью. При этом обнаружены значительные вариации ацетилирования К503. В частности, различный уровень ацетилирования остатка К503 в мозге самцов и самок может определять гендерные различия выраженности ингибирования фермента ГТФ. Данный результат согласуется с известными из независимых исследований гендерными различиями в развитии болезни Паркинсона у пациентов с мутацией глутаматдегидрогеназы по сайту связывания ГТФ.
4. Биоинформатический анализ тканевой специфичности экспрессии различных изоформ деацетилаз класса сиртуинов показал, что в мозге и печени варьирует соотношение как уровней их экспрессии, так и паттерны ацетилирования белков. Так, доминирующими изоформами в мозге являются цитоплазматический сиртуин 2 и митохондриальный сиртуин 3, а в печени - сиртуины 1 - 3. В соответствии с тканевой специфичностью экспрессии сиртуинов показаны различия пула ацетилированных белков в этих тканях: с помощью антител на ацетилированные остатки лизина определено значительное разнообразие ацетилированных белков разных масс в печени, тогда как в мозге доминирует одна полоса с молекулярной массой около 57 кДа.
5. Показано, что введение животным тиамина оказывает влияние на систему ацетилирования белков центрального метаболизма и циркадную регуляцию таких изменений. Так, корреляции между активностью, ацетилированием и экспрессией глутаматдегидрогеназы в гомогенатах коры мозга зависят от времени суток и снижаются под действием тиамина. При этом введение животным тиамина меняет регуляторные эффекты последующего in vitro ацетилирования глутаматдегидрогеназы в гомогенатах коры мозга.
6. В гомогенатах коры мозга крыс определена корреляция между активностью продуцента ацетил-КоА, пируватдегидрогеназного комплекса, и содержанием сиртуина 3 - регулятора ацетилирования митохондриальных ферментов. Выявлены обратные корреляции экспрессии сиртуина 3 с уровнем субстрата катализируемой им деацетилазной реакции - НАД+ - и активностями утилизирующих НАД+ ферментов-мишеней сиртуина 3: глутаматдегидрогеназы и малатдегидрогеназы.
7. При введении животным ингибитора пируватдегидрогеназы показаны биохимические изменения в системе ацетилирования мозга, сопровождающиеся физиологическими эффектами. Обнаруженные через 24 часа после введения изменения могут быть интерпретированы как компенсаторный ответ коры мозга на ингибирование продуцента ацетильных остатков - пируватдегидрогеназы. Хотя наблюдаемый эффект активации фермента (14%, р=0.2) в ответ на введение ингибитора не является достоверным в силу небольшой амплитуды и значительной вариабельности данного параметра между экспериментальными животными, уровень субстрата фермента НАД+ обнаруживает тенденцию к снижению (на 13%, р=0.076), а уровень аланина, находящегося в равновесии с субстратом пируватдегидрогеназы – пируватом - вследствие трансаминазной реакции, достоверно снижается на 11% (р=0,002). Достоверно меняются и биохимические индикаторы системы ацетилирования: наблюдается 2-кратное увеличение общего ацетилирования белков мозга (p=0.014) при 1,6-кратном росте содержания митохондриального сиртуина 3 (р=0.004). Одновременно с биохимическими изменениями в коре мозга наблюдали выраженные изменения показателей ЭКГ, отражающих регуляцию сердечного ритма, на фоне некоторого снижения общего уровня тревожности животных. Поскольку известным компонентом регуляции сердечной деятельности является синтезируемый из ацетил-КоА ацетилхолин, наши эксперименты показывают значительное физиологическое влияние изменений системы биологического ацетилирования, инициируемых пертурбацией такого продуцента ацетил-СоА как пируватдегидрогеназа. |
| Результаты этапа: Показано изменение уровня ацетилирования глутаматдегидрогеназы (ГДГ) в зависимости от времени суток, связанное с регуляцией функции фермента. Утром ацетилирование остатков лизина К84 (вблизи АДФ-сайта), К187 (рядом с активным центром) и К503 (связывание ГТФ) повышено по сравнению с вечером. При этом наблюдается высокая корреляция как между ацетилированием данных остатков ГДГ, так и между уровнями активности фермента без и в присутствии регуляторов. Вечером уровни ацетилирования остатков ГДГ снижаются, а корреляции пропадают. Эти суточные колебания ацетилирования ГДГ связаны с изменением реактивности фермента к его регуляторам АДФ, ГТФ и 2-оксоглутарату. Изменения таковы, что могут стабилизировать активность ГДГ при известных суточных вариациях уровней АДФ и ГТФ. Регуляция ГДГ этими метаболитами меняется при изменении суточной регуляции ацетилирования, наблюдающемся при введении крысам высокой дозы тиамина. Предложены молекулярные механизмы регуляции ГДГ при ацетилировании определенных остатков лизин фермента (Aleshin et al., 2020). Впервые показаны изменения аллостерической регуляции ГДГ мозга посредством ацетилирования, зависимые от времени суток и тиамина. Показан универсальный характер тиаминовой регуляции малат- и глутаматдегидрогеназ мозга животных (быка и крысы) (Меженская и др., 2020).
Проведение ацилирования ГДГ мозга и печени ацетил КоА и различными ангидридами позволило показать: (1) влияние модификации на каталитические и регуляторные свойства фермента в зависимости от типа модификации, (2) конкуренцию ацетилирования и глутарилирования при воздействии на ГДГ различных ангидридов и (3) частичную защиту функции ГДГ 2-оксоглутаратом при модификации уксусным, но не глутаровым ангидридом.
C использованием инкубации коммерческого препарата ГДГ с гомогенатами или митохондриями мозга в присутствии ингибиторов деацетилаз бутирата и/или никотинамида показано, что присущая митохондриям мозга деацетилазная активность соответствует не только сиртуинам, но и другим деацетилазам гистонового типа (HDAC). С учетом биоинформатического анализа экспрессии деацетилаз гистонового типа и уровней наблюдаемых деацетилазных активностей в митохондриях и гомогенате сделано предположение, что деацетилазы митохондрий мозга включают, помимо сиртуина 3, изоформу HDAC2. Данная серия опытов также предоставила свидетельства большей специфичности в отношении белковых субстратов реакций деацетилирования, чем ацетилирования.
Проведен поиск моделей, в которых можно было бы наблюдать повышение экспрессии р53 и/или его ацетилированной формы. В клеточных моделях (N2a, A549) рост уровня р53 происходил при тиаминовом дефиците и/или ингибировании тиаминдифосфат-зависимых ферментов. В мозге крыс экспрессия р53 росла в модели эмоционального стресса. Однако рост уровня ацетилированного р53 не совпадал с ростом экспрессии р53, указывая на специфические условия, индуцирующие данную модификацию. Например, увеличение уровня ацетилирования р53 зависело от того, каким образом создавали тиаминовый дефицит в клетках и/или от его комбинирования с ингибированием тиаминдифосфат-зависимых ферментов. В исследованных нами животных моделях нейропатологий мы не наблюдали роста ацетилирования р53.
В качестве регуляторов систем клеточного ацилирования в проекте используются ингибиторы комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот, продуцирущих ацетил-, сукцинил и глутарил-КоА. В 2019 г. охарактеризована специфичность действия фосфоновых аналогов 2-оксоглутарата и 2-оксоадипата на комплексы ОГДГ (ОГДК) и ОАДГ (ОАДК). Определена высокая специфичность действия фосфоновых аналогов 2-оксоглутарата (сукцинилфосфонат) и 2-оксоадипата (адипоилфосфонат) на гомологичные ОГДК и ОАДК при физиологических концентрациях субстратов in vitro и на клеточные метаболомы in vivo. Структурная характеристика взаимодействия модельной ОГДГ с сукцинилфосфонатом и его моноэтиловым эфиром (Wagner et al., 2019) показала, что существенный вклад в специфичность ингибирования вносят значительные конформационные перестройки фермента при связывании фосфоновых аналогов субстратов. Даже небольшие вариации структуры ингибитора меняют его взаимодействие с активным центром фермента, приводя к нарушению индуцированного связыванием перехода к прочному комплексу с ингибитором. Этот механизм хорошо соответствует значительной разнице в эффективности ингибирования ОГДК и ОАДК сукцинилфосфонатом и адипоилфосфонатом, наблюдаемой в эксперименте.
Добавление сукцинил-, глутарил- или адипоилфосфоната к клеткам позволило показать ожидаемую согласно данным in vitro специфичность действия аналогов на клеточные метаболомы, а также зависимость такого действия от экспрессии ОАДГ. По результатам этих исследований фосфоновые аналоги 2-оксоадипата (глутарилфосфонат) и 2-оксопимелата (адипоилфосфонат) предоставляют удобный инструмент для исследования роли ОАДГ-зависимой продукции глутарил-КоА в системе клеточного глутарилирования.
Для исследования системы глутарилирования нами были получены антитела на глутариллизиновые остатки белков. При иммуноферментном анализе белков гомогената мозга крысы показано, что расположение в геле основных полос, соответствующих глутарилируемым белкам, и изменение степени их глутарилирования совпадает с положением белковых полос и изменением экспрессии ОАДГ. По результатам этих экспериментов ОАДГ является одним из основных глутарилируемых белков мозга. Следует отметить, что существенно менее интенсивное окрашивание наблюдалось в области, соответствующей ГДГ мозга, несмотря на то, что антитела вырабатывались на глутариллизиновые остатки модифицированной глутаровым ангидридом ГДГ.
Введение крысам этерифицированной формы глутарилфосфоната, TEGP, привело к росту как экспрессии полосы ОАДГ 130 кДа, так и степени глутарилирования белковой полосы 130 кДа. Несмотря на рост экспрессии ОАДГ, не изменились ни внемитохондриальная активность ОАДК, ни уровень сиртуина 5. Это позволяет предположить инактивацию избытка экспрессированной ОАДГ при автоглутарилировании - реакции, аналогичной известному для других дегидрогеназ 2-оксокислот побочному процессу взаимодействия с субстратом. Введение этерифицированного адипоилфосфоната, ТМАР, не привело ни к росту экспрессии полосы ОАДГ массы 130 кДа, ни к росту глутарилирования белковой полосы 130 кДа. Однако при росте активности внемитохондриального ОАДК наблюдали падение уровня сиртуина 5. Можно предположить, что наблюдаемая разница в действии ингибиторов ОАДК на кору мозга крыс зависит от относительной эффективности их действия на ОАДК in vivo, в соответствии с которой клетка генерирует обнаруженные компенсаторные ответы.
В модели патологий беременности выявлена гендерная зависимость изменений внемитохондриальной активности ОАДК и экспрессии сиртуина 5 в коре головного мозга взрослого потомства, испытавшего пренатальную гипоксию, по сравнению с контрольными животными. У перенесших такой стресс самок активность внемитохондриального ОАДК падала параллельно с падением экспрессии сиртуина 5, тогда как у самцов пренатальная гипоксия приводила к росту экспрессии сиртуина 5 без достоверного изменения активности ОАДК. При этом гипоксия повышала уровень свободного триптофана, в катаболизме которого участвует ОАДК, в мозге и самцов, и самок. Действие ингибирующего ОАДК фосфонового аналога 2-оксоадипата – глутарилфосфоната – на контрольных животных ограничивалось повышением экспрессии сиртуина 5 у самцов и понижением того же параметра у самок, не влияя на контрольные уровни триптофана и активности внемитохондриального ОАДК. Введение же ингибитора ОАДГ крысам, перенесшим пренатальную гипоксию, имело более выраженный эффект у самок, чем у самцов. Так, у самок этой группы глутарилфосфонат восстановил пониженный уровень активности внемитохондриального ОАДК и понизил экспрессию сиртуина 5. тогда как существенных изменений данных параметров у самцов не наблюдали. При этом глутарилфосфонат нормализовал уровень триптофана в мозге у всех животных, перенесших пренатальный стресс. Полученные в данной модели результаты показывают, что система глутарилирования мозга характеризуется гендерными различиями и вовлечена в метаболизм триптофана - предшественника нейромедиатора серотонина.
В модели долгосрочных (спустя 8 недель) изменений коры головного мозга после спинномозговой травмы показаны изменения системы глутарилирования, связанные со степенью реабилитации животных (Boyko et al., 2019). При неизменной экспрессии ОАДГ в коре мозга травмированных крыс происходит увеличение внемитохондриальной активности ОАДК и повышение экспрессии сиртуина 5, для которых наблюдается положительная корреляция. Кроме того, уровень полноразмерной ОАДГ в коре мозга положительно коррелирует с восстановлением двигательных функций травмированных животных. Тиамин, введенный после травмы спинного мозга, повышает содержание сиртуина 5 и понижает до нормального уровня внемитохондриальную активность ОАДК. Введение ТМАР повышает белковую экспрессию ОАДГ и общее глутарилирование белков в коре головного мозга и у травмированных, и у ложнооперированных крыс. Однако у травмированных животных это сопровождается падением уровня сиртуина 5.
Таким образом, представленные в двух патофизиологических моделях – спинномозговой травмы и пренатальной гипоксии – данные свидетельствуют о том, что ОАДК участвует в долгосрочных изменениях системы глутарилирования белков в коре головного мозга крыс. |
