ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Рибосома является одной из основных мишеней антибиотиков в клетке. Данный проект направлен на разработку (дизайн) новых антибиотиков, действующих на Е-участок рибосомы. Через Е-участок во время транслокации рибосому покидает деацилированная тРНК. Блокирование Е-участка должно привести к остановке цикла работы рибосомы. Разработка новых антибиотиков именно к рибосоме облегчается тем, что в последние годы появились данные рентгеноструктурного анализа не только о структуре бактериальной рибосомы, но и эукариотической. Эти сведения позволяют проводить рациональный дизайн антибиотиков, которые будут обладать селективностью и, таким образом, смогут в перспективе стать основой для лекарственных препаратов. Работа по проекту состоит из трех этапов, которые, возможно, придется проходить многократно (итеративно). Во-первых, это дизайн новых соединений, потенциально способных взаимодействовать с Е-участком рибосомы на малой и большой субчастицах рибосомы. Во-вторых, это синтез запланированных соединений и, в-третьих, это тестирование способности синтезированных соединений ингибировать биосинтез белка in vitro и in vivo. Для создания лигандов для Е-участка малой субчастицы будут использованы структуры известных антибиотиков амикумацина, пактамицина и касугамицина. Разрабатываемые соединения будут содержать ароматическую систему, как пактамицин и амикумацин. Остальная часть молекулы потенциального гибридного антибиотика может быть взята из молекул амикумацина, пактамицина или касугамицина. Для придания специфичности антибиотик должен быть удлинен в сторону изобутильной группы амикумацина, чтобы создать стерические препятствия при связывании с эукариотической рибосомой. Именно в данной области в рибосоме эукариот находится петля рибосомного белка S14a. В создании потенциальных лигандов Е-участка рибосомы на большой субчастице мы планируем исходить из структуры комплекса рибосомы бактерий с тРНК. Мы полагаем, что можно создать соединение, по своей структуре напоминающее СА динуклеотид в той конформации, которая характерна для 3'-концевых нуклеотидов тРНК, связанной с бактериальной рибосомой.
Ribosome is one of the main antibiotic targets in the cell. The aim of the project is development of antibiotics targeting the E-site of bacterial ribosome. Through the E-site deacylated tRNA leaves the ribosome in the course of translocation. Occupation of the E-site by a small molecule would stop protein synthesis elongation. The aim seems feasible since the atomic structures are available for both bacterial and eukaryal ribosomes, which make possible a computer-based rational drug design approach. The project could be divided into three stages which might be applied iteratively. First is rational design of compounds, potentially able to interact with the E-site of the small or large ribosomal subunit. Second is synthesis of the designed chemicals and the third is testing of their ability to inhibit protein biosynthesis in vitro and in vivo. To create the ligands which would bind the E-site of the small ribosomal subunit we will use the structures of known antibiotics amicoumacin, pactamycin and kasugamycin. Designed compounds will have an aromatic system, similar to pactamycin and amicoumacin The rest of the hybrid antibiotic molecule would be combined from the side chains of antibiotics amicoumacin, pactamycin and kasugamycin. For increase of the antibiotics specificity we plan to introduce a bulky group at the side of amicoumacin isobutyl moiety aiming in creation of clashes with eukaryotic ribosome. In this side eukaryotic ribosome contain a loop of ribosomal protein S14a. To design potential ligands for the E-site of the large ribosomal subunit we will use an atomic structure of the tRNA complex with bacterial ribosome. We aim to create a compound mimicking the structure of CA dinucleotide in the conformation that could be observed in bacterial ribosome bound tRNA.
В результате выполнения проекта, на первом этапе будет сформирован виртуальный список соединений, потенциально взаимодействующих с Е-участком на малой и большой субчастицах рибосомы. Взаимодействие соединений из этого списка с рибосомой будет сначала моделироваться виртуально, с помощью программ молекулярной динамики, а затем, наиболее перспективные из них будут выбраны для органического синтеза. Синтезированные соединения будут проверены экспериментально на их способность взаимодействовать с рибосомой и ингибировать биосинтез белка у бактерий in vivo и in vitro. Селективность ингибиторов будет проверена с помощью линий клеток человека. В случае успеха, будет создана основа для дальнейшего усовершенствования ингибиторов рибосомы с перспективой создания антибиотиков, применимых в клинической практике.
Наш коллектив составляют специалисты в области исследования биосинтеза белка, в том числе и по поиску, синтезу и изучению новых антибиотиков, действующих на рибосому, специалисты в области молекулярного моделирования и методов компьютерной химии, химики – синтетики. В течении нескольких десятилетий исследуются молекулярные механизмы биосинтеза белка. Нашим коллективом было картировано расположение в бактериальной рибосоме мРНК, с помощью сайт направленного мутагенеза была исследована функциональная роль нескольких элементов рРНК, открыты шесть неизвестных ранее ферментов, модифицирующих рибосомную и транспортную РНК, изучена функциональная роль модификаций в процессе биосинтезе белка, разработан метод анализа белков, синтезированных рибосомой, и апробирован на модели ингибирования биосинтеза белка макролидным антибиотиком эритромицином. Для высокопроизводительного скрининга антибиотиков, ингибирующих трансляцию, создан специальный репортерный штамм, основанный на индукции гена флюоресцентного белка CER. С помощью этой системы скрининга и с использованием высокопроизводительной автоматизированной станции центра коллективного пользования НИИФХБ МГУ, среди культуральных жидкостей почвенных микроорганизмов обнаружен ингибитор трансляции, выделенный в дальнейшем с помощью многоступенчатой хроматографии и идентифицированный с помощью масс-спектрометрии, амикумацин, известный ранее антибиотик, механизм действия и молекулярная мишень которого были неизвестны. Нам удалось выяснить, что этот антибиотик связывается с Е-участком малой субчастицы рибосомы и замедляет транслокацию. Совместно с исследователями из США были определены молекулярный механизм действия амикумацина и структура его комплекса с рибосомой бактерий. У сотрудников коллектива имеется опыт проведения исследований белок-лигандных взаимодействий in silico с использованием методов молекулярного докинга. Т
Для направленного создания ингибиторов биосинтеза белка были выбраны участки Е-сайта малой и большой субъединицы рибосомы. За основу создания производных, потенциально связывающихся с Е-участком малой субчастицы, рибосомы решено было взять антибиотик амикумацин. Участок Е-сайта большой субъединицы существенно различается у рибосом бактерий и эукариот. Мы решили создавать вещества, потенциально связывающиеся с этим участком рибосомы, на основе аденозина, содержащего дополнительные группы в том месте, где должен находиться предпоследний цитозин тРНК. Был составлен широкий список производных амикумацина, аденина и аденозина, имеющих в своём составе гетероциклические (пирролидиновые, имидазольные), фосфорсодержащие (фосфорильные, аминофосфорильные, аминобис(фосфорильные), (фосфорил)фенильные), диарилметановые, ацетальные и макроциклические фрагменты, а также фрагменты пространственно-затруднённых фенолов Выбор соединений был осуществлен также по результатам молекулярного докинга и молекулярно-динамического моделирования, основанного на поиске структур, обладающих высоким сродством к рибосоме. На первом этапе рационального дизайна лигандов индивидуально для амикумацинового и ССА-сайтов были сконструированы библиотеки из 20 гипотетических соединений, которые являются производными амикумацина и аденозина соответственно. Проведен виртуальный скриниг этих библиотек. На основании анализа результатов докинга для каждого сайта созданы библиотеки, содержащие по 115 синтетически доступных соединений, и проведен их виртуальный скрининг. На основании обобщенного анализа значений оценочной функций Grid score и результатов кластерного анализа отобраны соединения для синтеза. В результате проведённых исследований отработан метод многостадийного синтеза основных синтонов, использующихся для получения амикумацина С (т.н. «аминный» и «кислотный» фрагменты). При этом найдены оптимальные условия проведения ряда реакций, предложены новые синтоны для синтеза модифицированного амикумацина. Осуществлена поэтапная оптимизация метода синтеза антибиотика амикумацина С, обеспечивающего повышение выхода конечного продукта. Осуществлен синтез ряда новых производных аденина: фосфорсодержащие пуриновые основания; производные дифенилпропана, содержащие в своём составе фрагмент аденина, а также реакционноспособную аминоацетальную группу у С6 атома углерода; дибензоксантеновое производное; новые водорастворимые производные аденина: диэтил (2-(6-амино-9H-пурин-9-ил)алкил)фосфонаты и фосфоновая кислота и фосфониевая соль на их основе; дифосфорилированные производные. Разработан эффективный метод синтеза новых пуриновых оснований, модифицированных диарилпропановыми группами. Синтезированные соединения были протестированы на антибактериальную активность с помощью репортерного штамма pDualrep2 и в системе внеклеточного синтеза белка. К сожалению, среди синтезированных соединений не оказалось способных ингибировать биосинтез белка. Аналогичным образом было проведено тестирование соединения a8id30, для которого в результате виртуального скрининга было предсказано связывание с Е-сайтом бактериальной рибосомы, однако ингибирующая активность оказалась низкой. Можно предположить, что со свободной рибосомой данное соединение взаимодействует так, как предсказывает молекулярно динамическое моделирование, однако тРНК взаимодействует с E сайтом бактериальной рибосомы сильнее и вытесняет его. В то же время было определено, что 2-гуанидино хиназолины обладают способностью ингибировать перемещение рибосомы по мРНК. В двойной репортерной системе pDualrep2 был также проверен антибиотик мадумицина II, аланин-содержащий стрептограмина А, механизм действия которого до тех пор оставался неясен. Далее механизм действия мадумицина II был изучен при помощи системы бесклеточной трансляции, для определения стадии, на которой действует мадумицин, был использован метод тоупринтинга. При помощи рентгеноструктурного анализа с разрешением 2.8 Å была проанализирована структура комплекса мадумицина с функционально активной 70S рибосомой Thermus thermophilus в присутствии мРНК и трех деацилированных тРНК в А-, Р- и Е-сайтах. Был обнаружен единственный сайт связывания антибиотика, располагающегося в пептидилтрансферазном центре большой субчастицы. Оказалось, что мадумицин II останавливает рибосому на первом (инициаторном) кодоне. Полученные данные раскрыли новые детали механизма действия этого класса антибиотиков. Мадумицин II ингибирует работу рибосомы перед образованием первой пептидной связи, препятствуя правильному позиционированию А- и Р-сайтовых тРНК, в результате чего пептидная связь образоваться не может. Впервые обнаружена вызываемая связыванием стрептограмина перегруппировка нуклеотидов U2506 и U2585 23S рРНК, в результате которой образуется паря U2506-U2583, характерная для неактивного состояния пептидил трансферазного центра. Параллельно экспериментам по синтезу и изучению рибосомных антибиотиков, проводилось исследование бактериальных рибосом методами молекулярной динамики. Показано, что рибосомы, связавшие две тРНК в А- и Р- или же Р- и Е- сайтах, находятся в различных конформационных состояниях, которые глобально отличаются друг от друга взаимным расположением сотен оснований рРНК. Передача аллостерических сигналов в рибосоме осуществляется за счет изменения невалентных взаимодействий оснований нуклеотидных остатков рРНК; при этом легко перестраивающиеся участки рРНК перемежаются плотно упакованными стабильными элементами ее макромолекулы, что позволяет превращать микроизменения в макросмещения в структуре рибосомы. Найдены закономерности в конформационных изменениях 16S и 23S рРНК при связывании тРНК в Е-сайте. Эти результаты расширяют знания о механизмах регулирования работы рибосомы ингибиторами, а также способствуют дальнейшему улучшению молекул, имеющих потенциал быть использованными в медицинской практике
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 мая 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Создание антибиотиков, направленных на Е-участок рибосомы |
Результаты этапа: Составлен список соединений, потенциально связывающихся с рибосомой. Для направленного создания ингибиторов биосинтеза белка были выбраны участки Е-сайта малой и большой субъединицы рибосомы. Поскольку наша лаборатория имеет приоритет и хороший задел в исследовании и получении амикумацина, именно эту молекулу решено было взять за основу создания производных, потенциально связывающихся с Е-участком малой субчастицы. Участок Е-сайта большой субъединицы существенно различается у рибосом бактерий и эукариот. Мы решили создавать вещества, потенциально связывающиеся с этим участком рибосомы, на основе аденозина, содержащего дополнительные группы в том месте, где должен находиться предпоследний цитозин тРНК. При выборе соединений для дальнейшего синтеза учитывались синтетические возможности и задел нашего коллектива. В итоге составлен широкий список производных амикумацина, аденина и аденозина, имеющих в своём составе гетероциклические (пирролидиновые, имидазольные), фосфорсодержащие (фосфорильные, аминофосфорильные, аминобис(фосфорильные), (фосфорил)фенильные), диарилметановые, ацетальные и макроциклические фрагменты, а также фрагменты пространственно-затруднённых фенолов. Структуры этих соединений основаны на разработанных нами оригинальных методах синтеза азотсодержащих производных диарилметана, арилзамещённых имидазолидин-2-онов, 2-арилпирролидинов , аминофосфонатов и аминобис(фосфонатов), фосфорсодержащих производных бензальдегида и аминоацеталей, имеющих в своём составе стерически загруженные фенольные группы. Выбор соединений был осуществлен на основе сродства соединений к рибосоме по результатам молекулярного докинга и молекулярно-динамического моделирования. На первом этапе рационального дизайна лигандов индивидуально для амикумацинового и ССА-сайтов сконструированы библиотеки из 20 гипотетических соединений, которые являются производными амикумацина и аденозина соответственно. Проведен виртуальный скриниг этих библиотек. На основании анализа результатов докинга для каждого сайта созданы библиотеки, содержащие по 115 синтетически доступных соединений, и проведен их виртуальный скрининг. На основании обобщенного анализа значений оценочной функций Grid score и результатов кластерного анализа отобраны соединения для синтеза. Среди ранее синтезированных соединений, имеющихся в наличии, определены те, которые способны ингибировать биосинтез белка. Для всех этих соединений была также проверена способность ингибировать внеклеточную систему трансляции мРНК люциферазы светлячка в бактериальном экстракте. Также была проверена способность ингибировать внеклеточный синтез белка, эффективность которого оценивали по включению флуоресцентно меченной аминокислоты в полноразмерный белок и способность ингибирования синтеза белка in vivo. Для соединения АЕ17 показана способность ингибировать биосинтез белка во внеклеточной системе и в живых клетках. | ||
2 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Создание антибиотиков, направленных на Е-участок рибосомы |
Результаты этапа: Синтез производных амикумацина. Оптимизация метода синтез амикумацина С: Несмотря на то, что полный синтез амикумацина С описан в достаточно большом количестве работ, его осуществление до сих пор является сложной задачей. Основным недостатком практически всех известных методов является их плохая воспроизводимость. В связи с этим, нами была осуществлена поэтапная оптимизация метода синтеза амикумацина С на основе наиболее хорошо зарекомендовавших себя подходов, описанных в литературе [1-3]. Взаимодействием L-лейцина с тионилхлоридом и метанолом получен соответствующий метиловый эфир, который был подвергнут бензилированию с образованием метил N,N-дибензил-L-лейцината 2 с выходом 98%. Найдены оптимальные условия превращения полученного лейцината в (S)-2-(дибензиламино)-N-метокси-N4-диметилпентамид 3 (амид Вейнреба) (Схема 1). Впервые разработан двухстадийный метод синтеза N,N-диэтил-2-метокси-6-метилбензамида 6 из коммерчески доступного этилового эфира 2-метокси-6-метилбензойной кислоты (Схема 1). 2. Оптимизация метода синтеза (4S,5S)-5-((S)-3-этил-11,11-диметил-5,9-диоксо-4,10-диокса-3,8-диазадодекан-7-ил)-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбоновой кислоты («кислотный фрагмент») В результате 9-стадийного синтеза исходя из N-Boc-защищённого L-лейцина 9 получено соединение 18 («кислотный фрагмент») (Схема 2). Ацилированием кислоты Мёльдрума промежуточным ангидридом, полученным in situ в результате взаимодействия N-Boc-защищенного L-лейцина 9 с изопропенилхлорформиатом, получен (S,S)-5-бензил-4-гидрокси-1-трет-бутоксикарбонилпиррол-2(5H)-он 10; кипячением в метаноле он был превращён в трет-бутил-(S)-2-бензил-3-гидрокси-5-оксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-карбоксилат 11, который был восстановлен в мягких условиях до соответствующего пирролидина 12 с выходом 70%. В результате последовательных реакций дегидратации пирролидина 12, и окисления двойной связи полученного пиррола 13 был получен диол 14, гидроксильные группы которого были защищены путем их перевода в кетальную форму с образованием соединения 15. Далее бензольное кольцо 15 было подвергнуто окислению по методу Шарплеса до кислоты 16, которая была подвергнута конденсации с диэтиламином с образованием соответствующего амида 17. Проведена оптимизация условий проведения всех упомянутых реакций, направленная на повышение выхода конечного продукта 18 (Схема 2). 3. Впервые осуществлена конденсация кислоты 16 (2-((3aS,4S,6aS)-5-(трет-бутоксикарбонил)-2,2-диметил-6-оксотетрагидро-4H-[1,3]диоксоло[4,5-c]пиррол-4-ил)уксусной кислоты) с диметилацеталем аминоуксусного альдегида. Продукт конденсации 19 образуется в присутствии 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, диметиламинопиридина и 1-бензотриазола в среде дихлорметана с удовлетворительным выходом (Схема 3). Синтез производных аденозина и аденина. Синтез производных аденина. 1. Изучено взаимодействие аденина с аминоацеталями различного строения в кислых средах. Установлено, что аденин не вступает во взаимодействие с аминоацеталями даже при кипячении в присутствии сильных минеральных кислот и суперкислоты (СF3SO3H). 2. Впервые с целью получения пурина, содержащего аминоацетальные группы, изучены реакции 2-бромо-1,1-диметоксиэтана 21 и 2-(2-бромэтил)-1,3-диоксолана 20 с аденином. Взаимодействием аденина и 2-(2-бромэтил)-1,3-диоксолана в ДМФА в присутствии пятикратного избытка поташа получен 9-(2-(1,3-диоксолан-2-ил)этил)-9H-пурин-6-амин 22. Установлено, что 2-бромо-1,1-диметоксиэтан 21 не вступает в реакцию с аденином в аналогичных условиях. 3. Впервые установлено, что взаимодействие аденина с фосфорилированными метиленхинонами 24 приводит к образованию продуктов 1,6-присоединения 25. Фосфорилированные аденины, содержащие пространственно-затрудненную фенольную группу, образуются при длительном кипячении реагентов в диоксане. 4. Впервые взаимодействием аденина с (тетраэтил)этилиденбисфосфонатом и тетракис(триметилсилил)этилиден-1,1-бисфосфонатом получены производные, содержащие в структуре две этилиденбисфосфорильные группы 26, 27. (Схема 7,8) Производные аденозина 1. Cинтезирован 5′-хлоро-5′-деокси-2′,3′-O-изопропилиденаденозин 29 и изучено его взаимодействие с рядом аминов. Экспериментальные данные свидетельствуют о слабой активности Cl-замещеного аденозина в реакциях с аминами. В частности, при взаимодействии 5′-хлоро-5′-деокси-2′,3′-O-изопропилиденаденозина с N1,N1-диметилэтан-1,2-диамином и морфолином в ацетонитриле в присутствии карбоната калия и каталитических количеств KJ образование следовых количеств целевых продуктов регистрировалось только методом спектрометрии МАЛДИ. Варьирование растворителей (ацетон, ДМФА, ДМСО) не привело к увеличению выхода продуктов. Требуется дальнейшая оптимизация экспериментальных условий. 2. Для осуществления запланированной реакции Виттига осуществлен синтез фосфорсодержащих альдегидов по разработанным ранее методикам [16]. Изучено взаимодействие хлорзамещенного производного аденозина 29 с трифенилфосфином. Необходимым условием успешного осуществление реакции Виттига является образование фосфониевой соли 30. Как и в предыдущих реакциях, 5′-хлоро-5′-деокси-2′,3′-O-изопропилиденаденозин был малоактивен в реакции с трифенилфосфином. После 2 дней кипячения 5′-хлоро-5′-деокси-2′,3′-O-изопропилиденаденозина с трифенилфосфином в ДМФА реакция останавливалась и в спектре 31P наблюдались сигналы фосфониевой соли 30 (26.59 м.д) и не прореагировавшего трифенилфосфина 29 (-4.94 м.д.) в соотношении (1:12). Для успешной реализации этой задачи необходима дальнейшая оптимизация экспериментальных условий.. 3. Изучено взаимодействие 2′,3′-O-изопропилиденаденозина с ФОС-метиленхиноном и винилфосфонатами. Установлено, что данный нуклеозид не образует продуктов 1,6-присоединения с диалкил(3,5-ди-трет-бутил-4-оксоциклогекса-2,5-диенилиденметил)фосфонатом даже в жестких условиях (кипячение в диоксане). Впервые взаимодействием 5’-хлоро и 5’-гидрокси-2’, 3’-изопропилиденаденозинов с (тетраэтил)этилиденбисфосфонатом и тетракис(триметилсилил)этилиден-1,1-бисфосфонатом осуществлен синтез новых N6-производных аденозина, содержащих аминоэтиленбисфосфорильные группы. Наличие в полученных нуклеозидах аминоэтиленбисфосфорильных групп, позволяет ожидать проявление у них антирезорбтивной и антипролиферативной активности [7] (Схемы 11,12). 4. Впервые взаимодействием 2’,3’-O-изопропилиденаденозина 1 с рядом бисфосфоновых кислот 2a-c получены новые водорастворимые аддукты солевой природы 3a-c. Установлено, что длительное выдерживание полученных солей аденозина в воде при комнатной температуре приводит к мягкому снятию кетальной защиты и образованию соединений 4a-c с количественным выходом [8]. Тестирование синтезированных и очищенных соединений, производных аденина и AE17 в системе на репортерном штамме Как описано выше, в 2016 году были синтезированы производные аденина и амикумацина. Кроме того, группой А.Р. Бурилова синтезированы производные соединения AE17, показавшего антибактериальную активность и способность ингибировать биосинтез белка in vitro в прошлом году. Из успешно очищенных соединений (Таблица 1) была составлена панель для тестирования на репортерном штамме, способном детектировать вещества, ингибирующие биосинтез белка. Усовершенствованный репортерный штамм, используемый в данной работе, был создан при выполнении работ по другому гранту (соглашение о получении субсидии Минобрнауки 14.607.21.0086), поэтому его создание не входит в отчет по настоящему проекту. Тем не менее, применение нового репортерного штамма к данной панели соединений было сделано в данной работе. Новый репортерный штамм pDualrep2 способен детектировать одновременно два механизма действия антибактериальных соединений. Экспрессия дальне-красного флюоресцентного белка Katushka2S повышается в этом штамме при воздействии сублетальных концентраций антибиотиков, останавливающих биосинтез белка. В тоже время, экспрессия RFP, флюоресценция которого однозначно отлична от таковой для Katushka2S, повышается при повреждениях ДНК. Таблица 1. Соединения, синтезированные группой А.Р. Бурилова и протестированные с помощью репортерного штамма pDualrep2 Созданная панель потенциальных ингибиторов была протестирована с помощью репортерного штамма pDualrep2 (Рисунок 1). Оказалось, что вещества AE303, AE307 и AE348 обладают выраженной антибактериальной активностью. Бактериальная активность AE309, 608/16, 613/16, A247 и A260 оказалась слабой. Остальные соединения активностью не обладали. Индукцию репортерной системы синтезированные вещества не вызывали, что свидетельствовало об отсутствии у них способности ингибировать биосинтез белка. Соединения, обладающие антибактериальной активностью, были протестированы на токсичность по отношению к клеткам человека (Таблица 1). Наиболее перспективным нам показалось соединение 608/16, обладающее наименьшей токсичностью для эукариотических клеток при достаточной антибактериальной активности. Все соединения, обладающие активностью, а также производные аденина, вне зависимости от их активности in vivo, были протестированы в системе внеклеточного синтеза белка (Таблица 1). К сожалению, среди протестированных соединений не было обнаружено ингибиторов биосинтеза белка. Подавление синтеза белка in vitro, если и было, то только при максимальной концентрации и при остаточной активности белкового синтеза не менее 15%. Для сравнения, эритромицин в подобных условиях подавляет синтез белка до 0.08%. Мы надеемся, что когда синтез тех соединений, которые были отобраны методами докинга, будет завершен, результаты тестирования их активности окажутся более интересными. В 2016 году за счет средств гранта также была частично профинансирована работа по биохимическому анализу механизма действия нового класса ингибиторов биосинтеза белка, обнаруженных при высокопроизводительном скрининге соединений, финансируемых по соглашению о получении субсидии Минобрнауки 14.607.21.0086. В результате скрининга было обнаружено, что 2-гуанидино хиназолины обладают антибактериальной активностью, причем их мишенью служит ингибирование продвижения рибосомы по мРНК. Результаты этой работы, частично профинансированной из средств гранта РНФ, приняты к печати в журнале Biochimie. Все планируемые на год работы выполнены полностью: да Сведения о достигнутых конкретных научных результатах в отчетном году (до 5 стр.) В результате проведённых исследований отработан (найдены оптимальные условия) метод синтеза основных синтонов, использующихся для получения амикумацина С – (S)-3-((S)-1-амино-3-метилбутил)-8-метоксиизохроман-1-она и (4S,5S)-5-((S)-3-этил-11,11-диметил-5,9-диоксо-4,10-диокса-3,8-диазадодекан-7-ил)-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбоновой кислоты (т.н. «аминный» и «кислотный» фрагменты). Впервые осуществлена конденсация 2-((3aS,4S,6aS)-5-(трет-бутоксикарбонил)-2,2-диметил-6-оксотетрагидро-4H-[1,3]диоксоло[4,5-c]пиррол-4-ил)уксусной кислоты 16 (ключевого соединения в синтезе «кислотного фрагмента» амикумацина) с диметилацеталем аминоуксусного альдегида с получением первого представителя амида, содержащего ацетальные группы – нового синтона для синтеза модифицированного амикумацина. Впервые взаимодействием 5’-хлоро и 5’-гидрокси-2’, 3’-изопропилиденаденозинов с (тетраэтил)этилиденбисфосфонатом и тетракис(триметилсилил)этилиден-1,1-бисфосфонатом осуществлен синтез новых N6-производных аденозина, содержащих аминоэтиленбисфосфорильные группы. Впервые взаимодействием 2’,3’-O-изопропилиденаденозина с рядом бисфосфоновых кислот получены новые водорастворимые аддукты солевой природы. Впервые взаимодействием аденина с (тетраэтил)этилиденбисфосфонатом и тетракис(триметилсилил)этилиден-1,1-бисфосфонатом получены производные, содержащие в структуре две аминоэтилиденбисфосфорильные группы. Впервые взаимодействием диалкил(3,5-ди-трет-бутил-4-оксоциклогекса-2,5-диенилиденметил)фосфоната с аденином получены производные аденина, содержащие пространственно-затрудненную фенольную группу. Впервые взаимодействием аденина с 2-бромо-1,1-диметоксиэтаном и 2-(2-бромэтил)-1,3-диоксоланом получен 9-(2-(1,3-диоксолан-2-ил)этил)-9H-пурин-6-амин – новый синтон для синтеза пуринового основания, содержащего диарилметановые группы. Все соединения, выделенные в чистом виде, были протестированы с помощью репортерного штамма pDualrep2 и в системе внеклеточного синтеза белка. Среди протестированных соединений не обнаружено активных ингибиторов биосинтеза белка. Поскольку на данном этапе тестированию подвергались промежуточные соединения в синтезе целевых ингибиторов, предсказанных на основе компьютерного анализа, их неактивность является достаточно ожидаемой. Тестирование токсичности соединений, обладающих антибактериальной активностью, выявило, что соединение 608/16 обладает низкой токсичностью при хорошей антибактериальной активности. Определено, что 2-гуанидино хиназолины обладают способностью ингибировать перемещение рибосомы по мРНК. Все запланированные в отчетном году научные результаты достигнуты: да. | ||
3 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Создание антибиотиков, направленных на Е-участок рибосомы |
Результаты этапа: Для направленного создания ингибиторов биосинтеза белка были выбраны участки Е-сайта малой и большой субъединицы рибосомы. За основу создания производных, потенциально связывающихся с Е-участком малой субчастицы, рибосомы решено было взять антибиотик амикумацин. Участок Е-сайта большой субъединицы существенно различается у рибосом бактерий и эукариот. Мы решили создавать вещества, потенциально связывающиеся с этим участком рибосомы, на основе аденозина, содержащего дополнительные группы в том месте, где должен находиться предпоследний цитозин тРНК. Был составлен широкий список производных амикумацина, аденина и аденозина, имеющих в своём составе гетероциклические (пирролидиновые, имидазольные), фосфорсодержащие (фосфорильные, аминофосфорильные, аминобис(фосфорильные), (фосфорил)фенильные), диарилметановые, ацетальные и макроциклические фрагменты, а также фрагменты пространственно-затруднённых фенолов Выбор соединений был осуществлен также по результатам молекулярного докинга и молекулярно-динамического моделирования, основанного на поиске структур, обладающих высоким сродством к рибосоме. На первом этапе рационального дизайна лигандов индивидуально для амикумацинового и ССА-сайтов были сконструированы библиотеки из 20 гипотетических соединений, которые являются производными амикумацина и аденозина соответственно. Проведен виртуальный скриниг этих библиотек. На основании анализа результатов докинга для каждого сайта созданы библиотеки, содержащие по 115 синтетически доступных соединений, и проведен их виртуальный скрининг. На основании обобщенного анализа значений оценочной функций Grid score и результатов кластерного анализа отобраны соединения для синтеза. В результате проведённых исследований отработан метод многостадийного синтеза основных синтонов, использующихся для получения амикумацина С (т.н. «аминный» и «кислотный» фрагменты). При этом найдены оптимальные условия проведения ряда реакций, предложены новые синтоны для синтеза модифицированного амикумацина. Осуществлена поэтапная оптимизация метода синтеза антибиотика амикумацина С, обеспечивающего повышение выхода конечного продукта. Осуществлен синтез ряда новых производных аденина: фосфорсодержащие пуриновые основания; производные дифенилпропана, содержащие в своём составе фрагмент аденина, а также реакционноспособную аминоацетальную группу у С6 атома углерода; дибензоксантеновое производное; новые водорастворимые производные аденина: диэтил (2-(6-амино-9H-пурин-9-ил)алкил)фосфонаты и фосфоновая кислота и фосфониевая соль на их основе; дифосфорилированные производные. Разработан эффективный метод синтеза новых пуриновых оснований, модифицированных диарилпропановыми группами. Синтезированные соединения были протестированы на антибактериальную активность с помощью репортерного штамма pDualrep2 и в системе внеклеточного синтеза белка. К сожалению, среди синтезированных соединений не оказалось способных ингибировать биосинтез белка. Аналогичным образом было проведено тестирование соединения a8id30, для которого в результате виртуального скрининга было предсказано связывание с Е-сайтом бактериальной рибосомы, однако ингибирующая активность оказалась низкой. Можно предположить, что со свободной рибосомой данное соединение взаимодействует так, как предсказывает молекулярно динамическое моделирование, однако тРНК взаимодействует с E сайтом бактериальной рибосомы сильнее и вытесняет его. В то же время было определено, что 2-гуанидино хиназолины обладают способностью ингибировать перемещение рибосомы по мРНК. В двойной репортерной системе pDualrep2 был также проверен антибиотик мадумицина II, аланин-содержащий стрептограмина А, механизм действия которого до тех пор оставался неясен. Далее механизм действия мадумицина II был изучен при помощи системы бесклеточной трансляции, для определения стадии, на которой действует мадумицин, был использован метод тоупринтинга. При помощи рентгеноструктурного анализа с разрешением 2.8 Å была проанализирована структура комплекса мадумицина с функционально активной 70S рибосомой Thermus thermophilus в присутствии мРНК и трех деацилированных тРНК в А-, Р- и Е-сайтах. Был обнаружен единственный сайт связывания антибиотика, располагающегося в пептидилтрансферазном центре большой субчастицы. Оказалось, что мадумицин II останавливает рибосому на первом (инициаторном) кодоне. Полученные данные раскрыли новые детали механизма действия этого класса антибиотиков. Мадумицин II ингибирует работу рибосомы перед образованием первой пептидной связи, препятствуя правильному позиционированию А- и Р-сайтовых тРНК, в результате чего пептидная связь образоваться не может. Впервые обнаружена вызываемая связыванием стрептограмина перегруппировка нуклеотидов U2506 и U2585 23S рРНК, в результате которой образуется паря U2506-U2583, характерная для неактивного состояния пептидил трансферазного центра. Параллельно экспериментам по синтезу и изучению рибосомных антибиотиков, проводилось исследование бактериальных рибосом методами молекулярной динамики. Показано, что рибосомы, связавшие две тРНК в А- и Р- или же Р- и Е- сайтах, находятся в различных конформационных состояниях, которые глобально отличаются друг от друга взаимным расположением сотен оснований рРНК. Передача аллостерических сигналов в рибосоме осуществляется за счет изменения невалентных взаимодействий оснований нуклеотидных остатков рРНК; при этом легко перестраивающиеся участки рРНК перемежаются плотно упакованными стабильными элементами ее макромолекулы, что позволяет превращать микроизменения в макросмещения в структуре рибосомы. Найдены закономерности в конформационных изменениях 16S и 23S рРНК при связывании тРНК в Е-сайте. Эти результаты расширяют знания о механизмах регулирования работы рибосомы ингибиторами, а также способствуют дальнейшему улучшению молекул, имеющих потенциал быть использованными в медицинской практике |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".
№ | Имя | Описание | Имя файла | Размер | Добавлен |
---|