Исследования структурно-функциональной организации и биогенеза пигментных фоторецепторных систем.НИР

Investigation of the structure-function organization and biogenesis of the photoreceptor systems.

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Исследования структурно-функциональной организации и биогенеза пигментных фоторецепторных систем.
Результаты этапа: Структурные и функциональные особенности основного фоторецептора растений фитохрома А изучали методом низкотемпературной флуоресцентной спектроскопии в растительной клетке in vivo. Были получены доказательства того, что два нативных пула фитохрома А различаются по степени фосфорилирования серина в N-концевом сегменте молекулы, что сопряжено с их функциональными различиями – активностью пулов в сверхнизкоэнергетических или высокоэнергетических фотоответах, определяющих ростовую реакцию и адаптацию растений к изменяющимся условиям окружающей среды. Были проведены оптические и электрофизиологические исследования природных анионных канальных родопсинов криптофитовых водорослей. Очищенные препараты этих белков были получены путем гетерологической экспрессии их генов в клетках метанотрофных дрожжей, а анализ фотоэлектрической активности этих белков был проведен посредством пэтч-кламп регистрации на модельных культивируемых клетках животных. Был охарактеризован цикл фотохимических превращений этих белков и выявлена корреляция фаз этого цикла с кинетикой фототоков, генерируемых в ответ на наносекундное лазерное возбуждение. Путем исследования специфических мутантов были выявлены аминокислотные остатки, определяющие кинетические параметры двух фаз цикла и работы канала. Был проведен электрофизиологический анализ 17 гомологичных белков из различных видов криптофитовых водорослей и установлено, что все они обладают светозависимой анионной канальной активностью. Было показано, что экспрессия анионных канальных родопсинов в кардиомиоцитах может быть использована для фотоподавления электрической активности этих клеток, а также для регуляции длительности потенциала действия при помощи света. Полученные результаты способствуют лучшему пониманию механизмов анионной канальной проводимости и могут быть использованы для усовершенствования оптогенетических методов исследования и терапии. Показано, что выход триплетных состояний хлорофилла в коровых комплексах фотосистемы 2 хлоропластов возрастает при восстановлении хинонов, но даже в этом случае примерно на порядок величины меньше, чем в изолированных РЦ хлоропластов. Из полученных данных следует, что в коровых комплексах имеются два пула триплетных состояний хлорофилла: один связан с антенной, другой с рекомбинацией заряда в реакционных центрах. Обнаруженные триплетные состояния могут быть источником синглетного кислорода, приводящего к деструкции нативных структур. Действительно, нами показано, что при действии красного света (660 нм) мощного светодиода происходит достаточно быстрое разрушение хлорофилла в суспензии коровых комплектов. При генерации синглетного кислорода путем прямого лазерного возбуждения (2 Вт) растворенного кислорода разрушения комплексов не наблюдали. Данные показывают, что фотодеструкция коровых комплексов, вероятно, определяется фотосенсибилизированной хлорофиллом генерацией синглетного кислорода обнаруженными триплетными состояниями. Обнаружено, что механизм долговременной адаптации как к использованному в качестве контроля белому свету люминесцентных ламп, так и к узкополосному красному и синему свету, одинаков и заключается в перемещении мобильной антенны светособирающего комплекса фотосистемы 2 (тример LHCII) к ССК фотосистемы 1. Особенность адаптации к красному свету, заключающаяся в большей по сравнению с контролем относительной флуоресценцией ССК фотосистемы 1 (F735/F684), объясняется изменением структурной организации хлоропластов (отсутствие четкой организации гран, большое количество гранальных мембран, неправильная форма гран с выступающими многочисленными тилакоидами). Эти изменения могут обеспечивать сближение двух фотосистем, приводящее к увеличению миграции энергии с фотосистемы 2 на ССК фотосистемы 1, а также облегчение перемещения LHCII к фотосистеме 1.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Исследования структурно-функциональной организации и биогенеза пигментных фоторецепторных систем.
Результаты этапа: 1. Поиск природных вариантов АКР, перспективных для оптогенетики. Мы предположили, что белки, гомологичные АКР G. theta, должны присутствовать и у других видов криптофитов, и связались с международным консорциумом, занимающимся глобальным секвенированием транскриптомов растений. Биоинформационый анализ транскриптомов криптофитов позволил нам идентифицировать несколько десятков гомологов первых АКР из G. theta. Сравнение новых последовательностей с таковыми ранее известных катионных канальных родопсинов, выделенных из зеленых водорослей, выявило существенные различия между этими двумя семействами белков. Мы синтезировали полинуклеотиды, кодирующие мембранные домены тридцати пяти новых АКР, и исследовали их путем экспрессии в культуре модельных клеток НЕК293 и пэтч-кламп регистрации фототоков. Около двух третей последовательностей оказались способными к анионной канальной активности в культуре клеток. Измерение спектров действия фототоков показало, что максимум поглощения природных АКР вариирует в диапазоне от 440 до 535 нм. Большинство исследованых АКР генерируют сравнительно небольшие токи, но амплитуда токов по крайней мере трех новых вариантов превосходит таковую у ранее известных АКР из G. theta и, следвательно, эти новые белки представляют собой интерес для оптогенетики. Один из трех, названный ZipACR, обладает дополнительными преимуществами: быстрым закрытием канала (характерное время 2-4 мс в зависимости от мембранного потенциала) и максимальной спектральной чувствительностью при 520 нм. Мы показали, что экспрессия ZipACR в культуре нейронов мыши позволяет подавлять индивидуальные потенциалы действия при частоте их генерации по крайней мере до 50 Гц, что существенно превышает доступный ранее порог. 2. Новый фотохимический метод исследования фотогенерации синглетного кислорода при физиологических условиях. В ходе предшествующего этапа был использован разработанный в нашей лаборатории фосфоресцентный метод регистрации триплетного состояния хлорофилла. Установлено, что в изолированных реакционных центрах ФС-2, коровых комплексах фотосистемы 2 и изолированных хлоропластах при 77К образуется миллисекундное триплетное состояние хлорофилла с временем жизни 1,6-2 мс, выход которого максимален в изолированных РЦ, на два порядка меньше в коровых комплексах и еще на порядок меньше в хлоропластах. Это привело к представлению, что во всех объектах при комнатной температуре за счет переноса энергии от триплетного состояния на кислород должно происходить образование синглетного кислорода. В ходе настоящего этапа разработан чувствительный метод обнаружения генерации синглетного кислорода хлорофиллом в фотосинтетическом аппарате и модельных системах при комнатной температуре. Метод основан на использовании ловушки синглетного кислорода – 1,3 дифенилизобензо-фурана, солюбилизированной в водных системах мицеллами детергента н-додецил--D-мальтозида, входящего в состав буферного раствора БТС, который используется в выделении и анализа активности фрагментов хлоропластов. Показано, что квантовый выход синглетного кислорода в изученных компонентах фотосинтетического аппарата весьма высок и практически равен выходу синглетного кислорода в водных детергентных растворах хлорофилла а. В хлоропластах выход сиглетного кислорода существенно снижен. Полученные данные качественно соответствуют результатам экспериментов предшествующего этапа по выходу фосфоресценции и скорости выцветания хлорофилла в изученных объектах под действием красного света. Однако количественное соответствие отсутствует. Анализ показывает, что в коровых комплексах синглетный кислород в основном генерируется короткоживущими триплетными молекулами хлорофилла, которые не детектируются фосфоресцентным методом. Работа выполнена совместно с ФИЦ биотехнологии РАН (Москва) и Институтом Фундаментальных проблем биологии (Пущино). 3. Исследование структуры и функций пулов фитохрома А Работу проводили по трем направлениям. Во-первых, были завершены эксперименты по выяснению роли фитохромов в фоторегуляторных реакциях одно- и двудольных растений в УФ-А области спектра. Установлена зависимость фотоморфогенетических эффектов от генотипа растения, органа растения и интенсивности освещения. Прослежена специфика влияние УФ-А на содержание фитохрома А и его нативных пулов в проростках гороха и риса. С использованием бесфитохромных мутантов выявлена роль фитохромов А, В и С в регуляции роста растений под действием УФ-А. Во-вторых, продолжены начатые ранее исследования регуляторных взаимодействий фитохрома А с гормональной системой с использованием мутантов риса hebiba и cpm2, дефицитных по жасмоновой кислоте. Обнаружено влияние мутации cpm2 на состояние фитохрома А и соотношение его пулов в темновых условиях, отличное от обнаруженного нами ранее влияния hebiba в условиях освещения. Установленная специфика действия cpm2 по сравнению с hebiba предполагать более сложные генетические перестройки в этом мутанте. Наконец, начаты принципиально важные для понимания структурных и функциональных различий двух типов фитохрома А исследования трансгенных растений арабидопсис, экспрессирующих мутантный фитохром А (овса) с точечной заменой аминокислот, по которым осуществляется фосфорилирование пигмента. Ранее нами были получены доказательства того, что phyA’ и phyA’’ различаются по степени фосфорилирования серина в N-концевом сегменте молекулы: phyA’ фосфорилирован и phyA’’ дефосфорилирован (Sineshchekov et al., 2016). В отчетный период осуществлена наработка растительного материала, разработаны методики выращивания и изучения фотоответов, проведены установочные эксперименты с растениями арабидопсис дикого типа.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Исследования структурно-функциональной организации и биогенеза пигментных фоторецепторных систем.
Результаты этапа: 1. Новый фотохимический метод исследования фотогенерации синглетного кислорода в растворах и модельных системах. В ходе предшествующего этапа был использован разработанный в нашей лаборатории метод регистрации триплетного состояния хлорофилла, основанный на измерении его собственной фосфоресценции в ИК области. Совместно с ИФПБ РАН, этим методом были обнаружены миллисекундные триплетные состояния пигмента в хлоропластах и коровых комплексах ФС-2, фиксированных жидким азотом. Из этих экспериментов следовало, что во всех объектах при комнатной температуре за счет переноса энергии от триплетного состояния хлорофилла на кислород должно происходить образование синглетного кислорода. Разработанный нами метод обнаружения синглетного кислорода, основанный на использовании ловушки синглетного кислорода – 1,3 дифенилизобензо¬фу¬рана, показал, что образование синглетного кислорода в этих комплексах действительно происходит, причем выход синглетного кислорода примерно на порядок выше, чем это следует из фосфоресцентных измерений. Эти опыты говорят о том, что в фотосинтетическом аппарате образуются триплетные состояния, хлорофилла, которые не выявляются по измерениям фосфоресценции, возможно, из-за микросекундного времени жизни. В ходе отчетного года для моделирования этого процесса совместно с Институтом химии Коми научного центра Уральского отделения РАН (Сыктывкар) показано, что медные комплексы хлоринов – производных хлорофилла а, время жизни триплетного состояния которых – около 1 мкс эффективно генерируют синглетный кислород при фотовозбуждении. Установлено, что этот эффект полезен также для совершенно другой области знаний – фотомедицины, а изученные медные комплексы – могут служить новым классом фотосенсибилизаторов для фотодинами¬ческой терапии. Другим направлением работы в отчетном году была модернизация оборудования для измерения синглетного кислорода. Разработан новый люминесцентный спектрометр, позволяющий проводить стационарные и кинетические измерения фосфоресценции синглетного кислорода при фотовозбуждении пигментов в растворах и модельных системах. Спектрометр применен к анализу временных параметров синглетного кислорода в растворителях, не содержащих водородных атомов, которые являются удобной средой для анализа фотосенсибилизирующего действия пигментов. Показано, что время жизни синглетного кислорода в этих средах определяется тушением синглетного кислорода триплетными молекулами растворенного кислорода, фотосенсибилизаторами и молекулами растворителей. Совместно с ИФПБ РАН, используя эти среды и новый спектрометр показано, что каротиноиды (фитоин, фитофлуин и зета каротин) – предшественники β-каротина в биосинтезе эффективно генерируют синглетный кислород при фотовозбуждении. 2. Изучение возможной роли сериновых остатков в молекуле фитохрома А в дифференциации phyA на функциональные подпулы. Трансгенные растения, используемые в работе, были получены в лаборатории проф. J-Il Kim, Korea, путём введения гена фитохрома А овса (Avena sativa, AsphyA) в мутантный по phyA Arabidopsis (phyA-201). Использовали пять линий арабидопсиса – дикий тип, бесфитохромный мутант phyA-201, трансгенный phyA-201, экспрессирующий дикий тип фитохрома А овса (AsAox) и три трансгенные линии phyA-201 с соответствующими мутантами AsphyA (S8A, S18 A и S8/18A). Применяли два режима освещения, индуцирующего прорастание и развитие семян, – (1) белый свет от лампы накаливания в течение 15 мин или 3 ч сразу после выдерживания семян в темноте при температуре 4 градуса С и последующее их проращивание в темноте при температуре 24 градуса С в течение 4-5 дней (условие #1) и (2) дополнительное освещение в течение 2 ч тех семян, которые оставались покоящимися после 5 дней в темноте, после этого освещенные семена выдерживали ещё 4 дня в темноте при 24 градусах С (условие #2). Процедура измерения низкотемпературных спектров флуоресценции фитохрома и его превращений в фотопродукт при освещении красным светом описана нами ранее (Sineshchekov, 1994). Образцами для измерения были этиолированные гипокотили без семядолей. Все три линии трансгенного арабидопсиса, оверэкспрессирующие мутантный фитохром А овса, проявляли более высокий уровень прорастания, чем экспрессор phyA дикого типа. Этот факт согласуется с заключением (Han et al., 2010), что замещение S/A увеличивает функциональную чувствительность phyA как для VLFR так и для HIR. Спектральные характеристики phyA дикого типа и мутантного оказались существенно близкими друг к другу. Содержание фоторецептора также было практически одинаковым для всех линий. В отличие от этого, параметр, определяющий глубину фотохимического превращения Pr в фотопродукт lumi-R, варьировал в широких пределах, от 0 до 0.3 в зависимости от условий освещения, индуцирующего прорастание семян. Наименьшие значения были обнаружены у растений, выросших без предосвещения, и более высокие – после освещения семян в течение 3 ч. Эти вариации интерпретированы как проявление различия относительного содержания двух пулов phyA в гипокотилях, при этом характер его изменения в зависимости от способа предосвещения семян оставался одинаковым для всех линий – увеличение пропорции фотоактивного пула phyA’ с увеличением длительности освещения. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что мутантный phyA S/A представлен нативными пулами phyA’ и phyA” в той же пропорции, что и phyA дикого типа, и что трансгенные растения, экспрессирующие мутантный фитохром оказались существенно более чувствительными к действию света на прорастание семян. 3. Изучение взаимодействия сигнальных путей фитохрома А и фитогормона жасмоновой кислоты В отчетном году нами была продолжена совместная работа с группой проф. P. Nick, FRG, по изучению нативных свойств phyA в мутантах по жасмоновой кислоте с целью выяснения механизмов взаимодействия и взаимной регуляции этих двух регуляторных систем. Помимо hebiba в исследования был включен мутант cpm2. Для растений двух генотипов определяли морфологические параметры (характеристика побегов и корней), исследовали состояние фитохромной системы методом низкотемпературной флуоресценции, измеряли содержание неактивного (Protochl633) и активного (Protochl655) предшественников хлорофилла в тканях проростков. Использовали рис Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nihonmasari дикого типа (WT) и полученные на основе этого сорта мутанты hebiba и cpm2 (Riemann et al., 2003, 2013). Семена риса проращивали на водопроводной воде 5 дней при Т=24,5 оС в темноте, либо под дальним красным светом (FR) – прерывистым (FRp) или постоянным (FRc). Состояние и свойства фитохрома и протохлорофиллида определяли спектрально-флуоресцентным методом при низкой температуре на спектрофлуориметре Fluoromax-4P (Horiba). Был проведен сравнительный анализ морфологии, состояния фитохрома А и накопления предшественников хлорофилла у мутантов по синтезу жасмоновой кислоты с нарушенным геном аллен-оксид циклазы (АОС) - hebiba с полной потерей функции фермента и cpm2 с частичной ее потерей, но оба неспособные синтезировать JA (Riemann, M., et al (2013). Морфология проростков: выращенные в темноте 5 дней мутантные растения hebiba, cpm2 четко отличаются от WT проростков удлиненным мезокотилем и развитым корнем. В условиях низкоэнергетического освещения FRp побеги всех растений выравниваются, мутанты и растения дикого типа отличаются лишь по длине корня. Проявление мутации по АОС у обоих мутантов, вероятно, исчезает за счет активации синтеза JA активной формой фитохрома А. На возможность этого указывали Hsieh, Okamoto (2014). Освещение высокоэнергетическим светом ДКС (FRc) ингибирует рост растений дикого типа (короткие побеги до 10мм без корней), мутантные растения при этом имеют развитый главный корень и открытый лист. Фитохром. Предварительные данные говорят о тенденции увеличения общего содержания фитохрома в этиолированных мутантных растениях hebiba и cpm2. При действии FRp и FRc концентрация фоторецептора падает в разы. Низкоэнергетический FRp вызывает у hebiba и cpm2 увеличение доли phyA’’, a высокоэнергетический FRc – превращение практически всего фитохрома в активный пул phyA’. Протохлорофиллид. Мутанты cpm2 и hebiba различаются по накоплению протохлорофиллов и их регуляции. У hebiba прерывистый FRр практически не влияет на содержание активного протохлорофилла, тогда как у cpm2 его содержание падает. Под постоянным FRс во всех случаях значительно падает содержание протохлорофилла 655.
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Исследования структурно-функциональной организации и биогенеза пигментных фоторецепторных систем.
Результаты этапа: Целью нашего исследования является выяснение природы и функций обнаруженных нами ранее нативных пулов основного фитохрома растений – фитохрома А (phyA). Использовали оригинальный метод флуоресцентного и фотохимического изучения фитохрома in vivo. В отчетный период было продолжено выяснение связи phyA и его функционирования с активностью фитогормона жасмоната (JA). На мутантах (риса), дефицитных по этому гормону (hebiba и cpm2), полученных в лаборатории P. Nick (FRG), проведен сравнительный анализ состояния фитохрома А и его пулов (phyA′ и phyA″) в тканях и их активности в регуляции накопления предшественников хлорофилла в условиях освещения разными дозами дальнего красного света (ДКС). Установлено участие phyA в синтезе гормона JA и совместная (антагонистическая) регуляция биосинтеза предшественников хлорофилла фитохромом и JA. Вторым направлением работы явилось выяснение роли фосфорилирования в дифференциации phyA на подпулы (phyA′ и phyA″) и влиянии на их активность. Исследованы трансгенные растения Arabidopsis (получены J.-I. Kim, Rep. Korea), дефицитные по собственному phyA, но экспрессирующие фитохром А (овса) с точечными мутациями – заменами аминокислот в центральном сегменте молекулы (домен PHY), увеличивающими киназную активность молекулы phyA. Мутантные растения не отличались от дикого типа (LER) по общему содержанию пигмента. Прослежена, однако, разная функциональная активность фитохрома в обнаруженном нами ранее эффекте влияния предосвещения семян белым светом (БС) на соотношение пулов phyA′ и phyA″ в сформировавшихся этиолированных проростках. В мутантах практически весь phyA был представлен пулом phyA″ при предосвещении семян (БС от 15 мин до 3-6 ч), тогда как в диком типе его доля не превышает 40%. В то же время, не обнаружено отличий активности мутантных растений (замена Lys на Arg, K411R) от дикого типа в отношении накопления (прото)хлорофилла(-ида), тогда как проростки линий с заменами Tyr на Val (T418V) характеризовались его сравнительно высоким содержанием. Поскольку эти различия наблюдали как в темновых проростках, так и после предосвещения семян БС, можно полагать, что это связано с конститутивно фотоморфогенетическим фенотипом (сор) этого мутанта. В этиолированных растениях трансгенного арабидопсиса, экспрессирующих дефосфорилированный мутантный фитохром А (овса) с одиночными заменами Ser на Ala в N-терминальном расширении молекулы фитохрома (NTE) (получены J.-I. Kim, Rep. Korea), содержание протохлорофиллида (Pchlide), неактивного и активного, было снижено. Однако, в мутантах с заменами двух серинов NTE на аланины оно было сравнимо с таковым в линии дикого типа. В растениях арабидопсис, экспрессирующих фитохома А (риса) с заменами десяти терминальных Ser на Ala (предоставлены C. Bolle, FRG), содержание двух форм протохлорофиллидов в 1,5 раза выше, чем в линии сравнения. Наблюдаемые различия в содержании протохлорофиллидов в растениях с мутантным фитохромом А связаны, по-видимому, как с обнаруженным нами влиянием предосвещения семян на баланс пулов фитохрома А, так и с изменением общей его активности (показано в работах группах J.-I. Kim и C. Bolle). При этом, поскольку точечно мутировавший фитохром А в трансгенном арабидопсисе представлен обоими пулами phyА, можно полагать, что наблюдаемые эффекты связаны с изменением общей чувствительности фоторецептора, а не баланса его пулов. Напротив, линия с заменой 10 серинов на аланины по нашим данным содержит только phyA″, и влияние предосвещения на содержание двух форм протохлорофиллида (при постоянстве их соотношения) следует отнести на счет этой формы фоторецептора.
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Исследования структурно-функциональной организации и биогенеза пигментных фоторецепторных систем.
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".