ИСТИНА

Митохондрии, в соответствии с эндосимбиотической теорией, произошли от свободноживущих бактерий. В процессе эволюции митохондриальный геном подвергся существенной редукции, однако современные митохондрии все еще содержат ДНК, кодирующую около 10 белков (точное число варьирует в зависимости от организма) - ключевых компонентов комплексов дыхательной цепи. В связи с этим, для митохондрий характерна реализация всех основных механизмов поддержания генома и экспрессии генов. Биосинтез белка в митохондриях организован по бактериальному типу, но характеризуется рядом существенных отличий от трансляции у бактерий. К тому же, процессы митохондриальной трансляции механистически изучены еще далеко не полностью. Функциональной системы митохондриальной трансляции in vitro не существует, а исследования in vivo затруднены технической невозможностью вносить направленные изменения в митохондриальные геномы высших эукариот. Наша группа в течение 5 лет ведет исследования in vivo, посвященные биосинтезу белка в митохондриях пекарских дрожжей. Нами был идентифицирован ранее неизвестный третий фактор инициации данного процесса (mtIF3) - белок Aim23p (PMID: 22457064). Дальнейшие исследования показали, что данный фактор является неканоническим - в его отсутствие в митохондриях дрожжей трансляция не останавливается (как это происходит во всех других системах биосинтеза белка в отсутствие третьего фактора инициации), а всего лишь "разбалансируется": некоторых митохондриальных белков производится меньше, в то время как количества других возрастают в сравнении с дрожжами дикого типа (PMID: 26728900). Наши последние, еще неопубликованные данные свидетельствуют о том, что Aim23p также является ключевым компонентом системы регуляции митохондриальной трансляции и фактором стабилизации митохондриальных рибосом. mtIF3 из митохондрий клеток человека был идентифицирован существенно раньше, чем Aim23p, и являлся предметом множества исследований in vitro. Был показан механизм диссоциации рибосом на субчастицы под воздействием этого белка, выявлены его важнейшие структурные элементы и т.д. Однако ни одного эксперимента in vivo с данным белком поставлено не было, и эффекты, вызываемые отсутствием (или снижением концентрации) данного белка в митохондриях клеток человека, не описаны. Сегодня в распоряжении исследований имеются технологии сайленсинга генов при помощи малых РНК, а также методы редактирования генома in vivo, и решение данной задачи представляется вполне возможным. Данный проект посвящен анализу молекулярных эффектов снижения (вплоть до нуля) концентрации третьего фактора инициации трансляции в митохондриях культивируемых клеток человека. Наш опыт в проведении работ с ортологичным белком дрожжей указывает на то, что такие эффекты могут представлять существенный научный интерес.

According to the endosymbiotic theory, the mitochondria originated from free-living bacteria. During the evolution, the mitochondrial genome underwent significant reduction, but modern mitochondria still contain DNA encoding about 10 proteins (the exact number varies depending on the organism) - the key components of the respiratory chain complexes. In this regard, mitochondria are characterized by the realization of all the basic mechanisms for maintaining the genome and gene expression. The biosynthesis of proteins in the mitochondria is organized according to the bacterial type, but is characterized by a number of significant differences from the translation in bacteria. In addition, the processes of mitochondrial translation have not yet been fully mechanically studied. The functional system of mitochondrial translation in vitro does not exist, and in vivo studies are hampered by the technical inability to make directional changes to the mitochondrial genomes of higher eukaryotes. For 5 years our group has been conducting in vivo studies on the biosynthesis of proteins in the mitochondria of baker's yeast. We identified a previously unknown third factor of initiation of this process (mtIF3) - Aim23p (PMID: 22457064). Further studies have shown that this factor is non-canonical - in its absence in yeast mitochondria, translation does not stop (as it happens all other protein biosynthetic systems in the absence of the third initiation factor), but only becomes "unbalanced": some mitochondrial proteins are synthesized less, while the amounts of others increase in comparison with the yeasts of the wild type (PMID: 26728900). Our recent unpublished data indicate that Aim23p is also a key component of the mitochondrial translation regulation system and a factor of the stabilization of mitochondrial ribosomes. mtIF3 was identified in the mitochondria of human cells much earlier than Aim23p in yeast, and became the subject of many in vitro studies, investigating its ribosome-dissotiating mechanism and its most important structural elements. However, no experiments were performed in vivo with this protein so far and the effects caused by the absence or decrease in concentration of this protein in the mitochondria of human cells are not described. Today we possess the gene silencing technologies utilizing small RNAs, as well as in vivo genome editing methods suitable for solving this problem. This project is devoted to the analysis of molecular effects of decrease (including the zero level) of the concentration of the third factor of translation initiation in mitochondria of cultured human cells. Our experience in working with the orthologous yeast protein indicates that such effects may be of significant scientific interest.

В результате выполнения проекта мы ожидаем получить новые научные знания относительно роли третьего фактора инициации митохондриальной трансляции в клетках человека. Эти знания будут получены при помощи направленного снижения концентрации данного белка в клетках. Поскольку эксперименты на пекарских дрожжах привели к описанию нескольких неканонических функций ортологичного белка в митохондриях, мы предполагаем, что нам удастся получить похожие результаты и на клетках человека. Мы будем оценивать эффекты как при пониженных концентрациях белка, так при его полном отсутствии. Среди конкретных оцениваемых эффектов будут ключевые параметры, характеризующие функции митохондрий. Результаты данного проекта будут соответствовать мировому уровню исследований в данной области, что подтверждается фактом публикации полученных нами ранее аналогичных результатов для клеток пекарских дрожжей в высокорейтинговых научных изданиях (Nucleic Acids Research, Scientific Reports и др). Результаты проекта позволят нам получить более полную информацию о молекулярных механизмах процесса биосинтеза белка в митохондриях клеток человека. Это, в свою очередь, станет важным шагом на пути к созданию системы митохондриальной трансляции in vitro, которая крайне важна для любых прикладных исследований, связанных с митохондриями. Кроме того, результаты проекта позволят более детально описать различия между митохондриальной и бактериальной системами трансляции, что представляет огромный интерес в связи с необходимостью борьбы с митотоксическими эффектами рибосомных антибиотиков.

1. Руководитель участвует в проведении аналогичных работ на клетках дрожжей. Показано, что в отсутствие третьего фактора инициации митохондриальной трансляции у дрожжей данный процесс не останавливается (как это происходит во всех других системах биосинтеза белка в отсутствие третьего фактора инициации), а всего лишь "разбалансируется": некоторых митохондриальных белков становится меньше, в то время как количества других возрастают в сравнении с дрожжами дикого типа. Последние, еще неопубликованные данные свидетельствуют о том, что Aim23p также является ключевым компонентом системы регуляции митохондриальной трансляции и фактором стабилизации митохондриальных рибосом. 2. Руководитель имеет большой методологический опыт решения задач генной инженерии. 3. Руководитель имеет большой методологический опыт работы с клетками человека и с их митохондриями. Получена линия клеток человека, в которой экспрессия одного из белков митохондриальных рибосом подавлена при помощи РНК-интерференции.

1. Полная делеция гена MTIF3 не является летальной для клеток человека. 2. Делеция MTIF3 в клетках человека значительно снижает скорость их роста. 3. Делеция MTIF3 снижает экспрессию гена АТР 6 в митохондриях клеток человека и нарушает сборку АТФ-синтазы. 4. Делеция MTIF3 не влияет на архитектуру комплексов дыхательной цепи и поглощение кислорода клетками человека. 5. Неполное подавление экспрессии гена MTIF3 не приводит к нарушениям в митохондриальной трансляции, наблюдаемых при полном нокауте этого гена.