ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Компактизация хроматина является ключевым фактором сохранения целостности генома при клеточном делении, а также рассматривается в качестве важного элемента эпигенетической регуляции работы генов. Нарушение процессов компактизации может быть связано с развитием разнообразных патологических процессов, включая злокачественную трансформацию и старение. Несмотря на многолетние усилия исследователей, детальная структурная информация о топологии ДНК в составе хроматина, особенно на высших уровнях ее организации, практически отсутствует. В ходе выполнения работ по заявленной теме планируется исследовать способы компактизации ДНК в составе структурно-функциональных доменов хроматина разного уровня, в зависимости от их функционального статуса, при помощи методов ультраструктурного анализа и микроскопии с суперразрешением. Особое внимание будет уделено разработки новых технологий, обеспечивающих селективную недеструктивную визуализацию индивидуальных генных локусов в нативном хроматине (в том числе и in vivo), а также методы корреляционной оптической и электронной микроскопии.
Chromatin compaction is a key factor in maintaining the integrity of the genome during cell division, and is also considered as an important element in the epigenetic regulation of gene activity. Violation of the processes of compaction can be associated with the development of a variety of pathological processes, including malignant transformation and aging. Despite the many years of research efforts, detailed structural information on the DNA topology in chromatin, especially at the highest levels of its organization, is practically absent. In the course of work on the stated topic, it is planned to study methods of DNA compaction as a part of structurally functional chromatin domains of different levels, depending on their functional status, using ultrastructural analysis and superresolution microscopy. Particular attention will be paid to the development of new technologies that provide selective non-destructive visualization of individual gene loci in native chromatin (including in vivo), as well as methods of correlation optical and electron microscopy.
Будут разработаны методы недеструктивной визуализации индивидуальных генных локусов и проведен анализ динамики их пост-репликативной сегрегации на ультраструктурном уровне. С использованием разработанного нами ранее метода последовательного изучения ультратонких срезов в световом и электронном микроскопе будет охарактеризована организация реплицирующегося хроматина в ядрах клеток корневой меристемы Nigella damascena L. Будут описаны особенности морфологии паттернов репликации хроматина на разных этапах S-фазы, затем проанализирована организация реплицирующегося хроматина для разных этапов S-фазы, а также перестройки конденсированного хроматина во время и после репликации.
Разработаны новые методы селективного мечения хроматина для анализа 3D-структуры высших уровней организации хромосом в интеразе и митозе на основе применения иммунохимических подходов и использования генетически кодируемых меток, генерирующих контраст в режимах просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии. Данные методы использованы для анализа пострепликативной реорганизации хроматина и его митотической компактизации. Разработан методический подход для визуализации специфических хромосомных локусов в интерфазных ядрах для исследования организации хроматина методом криоэлектронной томографии. Для этой цели в качестве модельной системы использовались клеточные линии на основе NIH-3T3, экспрессирующие GFP-TALE, связывающиеся с главным сателлитом мыши. Визуализация прицентромерного гетерохроматина в такой системе осуществлялась с помощью иммуномечения антителами против GFP, коньюгированными с наночастицами золота. Для криоэлектронной томографии антитела предполагается вводить в ядро живых клеток с помощью микроинъекции. Для изготовления срезов для томографии клетки выращивали на сетках для электронной микроскопии, после инъекции клетки замораживали при помощи технологии plunge freezing и подвергали ионному травлению с использованием FIB-SEM. При помощи разработанной нами технологии селективного мечения эндогенных хромосомных локусов, дифференцированных по таймингу репликации, и адаптированного метода ChromEMT было показано, что в условиях сохранности нативной структуры хроматина на ультраструктурном уровне как рано реплицирующийся транскрипционно активный эухроматин, так и репрессированный поздно реплицирующийся гетерохроматин демонстрируют признаки иерархической укладки ДНК с четко идентифицируемым мотивом высокого уровня - хромонемой толщиной 100-150 нм. При этом динамика пост-репликативной реорганизации генных локусов предполагает отсутствие регулярной и детерминированной организации нуклеосомной фибриллы в составе хромонемы.
госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Принципы ультраструктурной организации интерфазных и митотических хромосом. |
Результаты этапа: разработаны новые методы селективного мечения хроматина для анализа 3D-структуры высших уровней организации хромосом в интеразе и митозе на основе применения иммунохимических подходов и использования генетически кодируемых меток, генерирующих контраст в режимах просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии. Данные методы использованы для анализа пострепликативной реорганизации хроматина и его митотической компактизации. | ||
2 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Принципы ультраструктурной организации интерфазных и митотических хромосом. |
Результаты этапа: Разработан методический подход для визуализации специфических хромосомных локусов в интерфазных ядрах для исследования организации хроматина методом криоэлектронной томографии. Для этой цели в качестве модельной системы использовались клеточные линии на основе NIH-3T3, экспрессирующие GFP-TALE, связывающиеся с главным сателлитом мыши. Визуализация прицентромерного гетерохроматина в такой системе осуществлялась с помощью иммуномечения антителами против GFP, коньюгированными с наночастицами золота. Для криоэлектронной томографии антитела предполагается вводить в ядро живых клеток с помощью микроинъекции. Для изготовления срезов для томографии клетки выращивали на сетках для электронной микроскопии, после инъекции клетки замораживали при помощи технологии plunge freezing и подвергали ионному травлению с использованием FIB-SEM. | ||
3 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Принципы ультраструктурной организации интерфазных и митотических хромосом. |
Результаты этапа: При помощи разработанной нами технологии селективного мечения эндогенных хромосомных локусов, дифференцированных по таймингу репликации, и адаптированного метода ChromEMT было показано, что в условиях сохранности нативной структуры хроматина на ультраструктурном уровне как рано реплицирующийся транскрипционно активный эухроматин, так и репрессированный поздно реплицирующийся гетерохроматин демонстрируют признаки иерархической укладки ДНК с четко идентифицируемым мотивом высокого уровня - хромонемой толщиной 100-150 нм. При этом динамика пост-репликативной реорганизации генных локусов предполагает отсутствие регулярной и детерминированной организации нуклеосомной фибриллы в составе хромонемы. | ||
4 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Принципы ультраструктурной организации интерфазных и митотических хромосом. |
Результаты этапа: 1) Разработан метод ультраструктурного изучения реплицирующегося хроматина в клетках растений, основанный на последовательном изучении ультратонких срезов сначала во флуоресцентном, а затем электронном микроскопе. В ходе тестирования разработанного метода выяснилось, что при анализе в электронном микроскопе срезы довольно значительно деформируются, причем возникающие деформации не могут быть компенсированы в ручном режиме из-за своей нелинейности. Поэтому для совмещения изображений, полученных с использованием светового и электронного микроскопов, разработана специальная программа, компенсирующая деформации при электронной микроскопии. Для этого использовались изображения хроматина во флуоресцентном микроскопе (окрашивание DAPI) и электронном микроскопе. Полученные в результате совмещения позволяют достаточно точно определить положение реплицирующегося хроматина на ультратонких срезах, что позволит в дельнейшем описать организацию хроматина в ходе репликации и после его завершения. 2) Разработана технология флуоресцентной и ультраструктурной локализации высокоповторяющихся и уникальных последовательностей ДНК in situ при помощи технологий CRISPR/dCas9 и TALE. Оптимизированы условия индукции экспрессии dCas для достижения наилучшего соотношения сигнал/шум. | ||
5 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Принципы ультраструктурной организации интерфазных и митотических хромосом. |
Результаты этапа: 1) Присутствие актина в ядре предполагает его участие в ядерных процессах: актин контролирует функциональную архитектуру ядра клетки, регулируя хроматин, участвует в процессах транскрипции и сборки рибонуклеопротеинов. Для исследования функциональных ролей изоформ актинов мы применяли метод малых интерферирующих РНК для избирательного уменьшения экспрессии изоформ. Работа проводилась на клеточных культурах карциномы легкого А549 и молочной железы MDA-MB-231. Были отработаны методики получения и культивирования клеточных культур с уменьшенной экспрессией цитоплазматических изоформ актина; проведен поиск мишеней, на которые влияет изменение экспрессии цитоплазматических изоформ актина, а также выявлен ряд морфологических особенностей ядерных структур клеток с пониженной экспрессией одной из изоформ. В результате исследования проведено описание морфологической реорганизации ядер клеток культуры А549, а также иммуноцитохимически выявлены и охарактеризованы белки ядерных спеклов (SC35), CENPA (Centromere protein A) и гистона H3/рН3 при изменении экспрессии изоформ актина. Это позволит провести более детальные исследования ядерных структур, выяснение морфологии которых поможет нашему пониманию ядерных функций цитоплазматических изоформ актина. 2) В 2020 году с использованием разработанного нами ранее метода последовательного изучения ультратонких срезов в световом и электронном микроскопе проведено изучение изменений структуры хроматина в ходе репликации хроматина. Основной упор был сделан на особые комплексы конденсированного хроматина - интерфазные хромонемы, которые описаны в составе интерфазных ядер некоторых растений. На первом этапе мы проанализировали ультраструктурную организацию ядер разных растений. В ядрах растений с большим геномом выявляются нитчатые комплексы хроматина - интерфазные хромонемы. Таким образом, появление таких комплексов является следствием увеличения размера генома. Для детального анализа мы использовали корешки Nigella damascena L. С использованием световой микроскопии мы показали, что репликация материала интерфазных хромонем происходит в средней S-фазе, причем, в ходе репликации происходит существенная перестройка структуры хромонем, которые почти полностью деконденсируются. Далее мы провели ультрастуктурный анализ такого деконеденсированного в ходе репликации хроматина. Корреляционная микроскопия чутко показывает, что материал хромонем деконденсируется не полностью, в составе деконденсированного хроматина выявляются отдельные небольшие комплексы конденсированного хроматина (эти комплексы плохо видны или вовсе не видны на свето микроскопическом уровне). Для выявления непосредственно реплицирующегося хроматина мы использовали флуоресцентную микроскопия после мечения EdU. Так как разрешение флуоресцентного микроскопа относительно невелико, мы считали, что репликация происходит в области наибольшей яркости (при этом размер зоны определить точно мы не могли). Тем не менее, полученные изображения показали, что в ходе репликации хроматин интерфазных хромонем полностью деконденсируется. Также мы провели такой анализ для хроматина, реплицирующегося в ранеей и позденей S-фазе. Рано-реплицирующийся хроматин (т.е. деконденсированный эухроматин) не менял своей организации в ходе репликации, а поздно-реплицирующийся (т.е. гетерохроматин) вел себя аналогично материалу интерфазных хромонем. Для анализа поведения хроматина интерфазных хромонем после репликации мы провели анализ распределения метки EdU в чейз-экспериментах. Полученные изображения свидетельствуют о том, что после репликации происходит формирование комплексов интерфазных хромонем, которые структурно неотличимы от комплексов в G1 ядрах. Таким образом, в 2020 году нами описаны особенности морфологии паттернов репликации хроматина на разных этапах S-фазы и проанализирована организация реплицирующегося хроматина для разных этапов S-фазы, а также перестройки конденсированного хроматина во время и после репликации. 3) Оптиизированы протоколы пробоподготовки для визуализации индивидуальных хромосомных локусов с субдиффракционным разрешением (oligo-STORM). |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".