Исследование механизмов дифференцировки и интеграции дифференцирующихся систем в развитии животных как основа совершенствования медицинских технологий.НИР

Research of the mechanisms of differentiation and integration of differentiated systems in the animal development as a basis of improvement of medical technologies.

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Исследование механизмов дифференцировки и интеграции дифференцирующихся систем в развитии животных как основа совершенствования медицинских технологий.
Результаты этапа:
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Исследование механизмов дифференцировки и интеграции дифференцирующихся систем в развитии животных как основа совершенствования медицинских технологий.
Результаты этапа: При отработке модификаций метода криоконсервации зрелых ооцитов млекопитающих ооциты мыши линии С57BL, полученные путем извлечения из яйцеводов после спаривания с вазэктомированным самцом, криоконсервировали с использованием бездиметилсульфоксидной криопротекторной среды. Состав среды: этиленгликоль 36%, фиколл 25%, сахароза 0,4М, растворенные в среде KSOM. Для проведения криоконсервации ооциты мыши очищали от клеток сorona radiata ферментным способом, выдерживали в предварительном растворе (криопротекторный раствор, разбавленный средой KSOM в 2 раза) в течение 2 мин., затем выдерживали в криопротекторном растворе в течение 2 мин. и помещали на носитель для замораживания. Размораживание проводили в растворе сахарозы (1М на среде KSOM) Выживаемость ооцитов оценивали по морфологическим признакам и способности к оплодотворению. 92% ооцита сохраняли морфологические признаки живого ооцита. Оплодотворение методом ИКСИ приводило к формированию пронуклеусов в 55% случаев от числа выживших ооцитов, что достоверно не отличается от контрольного оплодотворения интактных ооцитов методом ИКСИ. Однако развитие эмбрионов происходило с задержками и не приводило к формированию бластоцист. Продолжены работы по анализу функционального состояния ооцитов мыши, полученных из первичных фолликулов, выращенных in vitro в условиях 3D системы с использованием гидрогелевых альгинат-содержащих матриксов. Собран материал для проведения анализа активности генома клеток культивируемых фолликулов методом ПЦР в режиме реального времени. Были проведены исследования по сокультивированию первичных многослойных фолликулов с клетками стромы яичника в 3D культуре. Первичные культуры клеток стромы яичника человека получали из фрагментов криоконсервированной овариальной ткани и культивировали в монослое до 3-4 пассажа в стандартных (DMEM/F12; 20нг/мл bFGF, ИТС и 10% ФТС). Первичные многослойные фолликулы из яичников половозрелых самок мышей линии BDF1 и культивировали индивидуально в 3D условиях в системе «висячая капля» в течение 7 сут. В опытной группе к каждому фолликулу добавляли по 3000 ксеногенных клеток стромы яичника человека, к контрольным фолликулам клетки не добавляли. В опытной группе клетки и фолликулы формировали общую структуру, в которой ксеногенные клетки занимали поверхностное положение. Анализ экспрессии маркеров функционального состояния фолликулов проводили с помощью ПЦР в реальном времени с использованием видоспецифичных праймеров. Через 7 сут. в опытной группе, в сравнении с контрольной, возрастал уровень мРНК генов стероидогенеза CYP19A1 и андрогенов CYP17A1, рецепторов фолликулостимулирующего (FSHR) и лютеинизирующего (LHR) гормонов. Значимые различия выявлены только в экспрессии генов мыши, но не человека. То есть, сокультивирование овариальных фолликулов мыши с клетками первичной культуры стромы яичника человека приводило к активации процессов стероидогенеза в самом фолликуле, но не в добавленных клетках. Вероятно, добавление стромальных клеток к овариальным фолликулам стимулировало в них экспрессию функционально значимых для нормального роста и развития генов. При исследовании роли пространственных параметров при культивировании in vitro на поведение клеток млекопитающих получены первичные культуры клеток постмортального пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) глаза человека. Клетки ПЭС, выращиваемые в условиях монослойного 2D культивирования успешно формировали монослой и сохраняли высокий пролиферативный потенциал до 4 пассажа. На первых двух пассажах клетки в культуре имели эпителиальный фенотип, к 4 пассажу в культуре возрастало количество фибробластоподобных клеток. На 4 пассаже ПЭС экспрессировали ключевой пигмент ретиноидного цикла, участвующий в регенерации светочувствительного пигмента PRE65, а также свойственные мультипотентным мезенхимным стромальным клеткам поверхностные маркеры CD105, CD90, и не экспрессировали маркеры гемопоэтического и лимфоцитарного ряда. Переведение культуры ПЭС 4 пассажа в условия неадгезивного 3D культивирования приводило к формированию клеточных сфероидов. Сфероиды из клеток ПЭС формировались за 7сут за счет агрегации клеток в первые сутки и последующей компактизации. В составе сформированных сфероидов обнаружили две области: поверхностную и центральную. Клетки поверхностной области имели уплощенную форму, плотно прилегали друг к другу, клетки центральной области были округлыми, между ними постепенно накапливался внеклеточный матрикс. Были проведены эксперименты по изучению поведения клеток млекопитающих при культивировании на волокнах, изготовленных методом электроспиннинга из синтетических полимеров – поликапролактона и нейлона. В ходе предварительных экспериментов, проведенных на мезенхимных клетках, выделенных из костного мозга, было показано, что клетки обладают адгезией к субстрату из синтетических волокон, но необходимо модифицировать поверхность, чтобы сделать её более привлекательной для клеток. После покрытия поверхности пленок поли-L-орнитином наблюдали лучшее распластывание клеток. Было установлено, что при культивировании иммортализованных кератиноцитов человека (HaCaT) на ориентированных и неориентированных субстратах различается поляризация ядер клеток. У клеток, выращенных на ориентированных субстратах, поляризация ядер была выше, чем у клеток, выращенных на субстратах из волокон, уложенных хаотично. Также было показано, что актиновые микрофиламенты также ориентированы по направлению вдоль волокон субстрата. При исследовании репаративной регенерации позвоночных разработана новая простая воспроизводимая модель с целью изучения механизмов репарации и регенерации in vitro с применением современных методов лазерной микрохирургии клеточных сфероидов. Для этого с помощью наносекундного лазерного скальпеля провели микродиссекцию поверхностной и внутренней зон сфероидов из дермальных фибробластов. Для эффективной диссекции с сохранением жизнеспособности сфероида были подобраны оптимальные параметры «лазерного скальпеля». Уже в течение первого часа после воздействия на сфероиды лазерным излучением форма выживших после повреждения клеток изменялась - клетки на поверхности сфероида и непосредственно в области повреждения становились округлыми. Через сутки после микродиссекции структура сфероидов начинала частично восстанавливаться, клетки в поверхностных слоях начинали принимать исходную уплощенную форму, дебрис из погибших поврежденных клеток и их фрагментов постепенно исключался из состава сфероида. На предложенной модели получены первые данные по стимуляции восстановления структуры поврежденных сфероидов из дермальных фибробластов синтетическим пептидом Р199, который применяют в косметологии для инициации антивозрастных и регенерационных эффектов в коже. После микродиссекции восстановление структуры сфероидов из фибробластов с несколькими поверхностными слоями уплощенных черепицеобразно расположенных клеток и полигональными клетками внутренней зоны в присутствии пептида Р199 происходило быстрее, чем в контрольной группе, и завершалось в течение 7сут, предположительно за счет ремоделирования выживших клеток. При исследовании возрастных особенностей динамики репарационного восстановления пигментной системы личинок амфибий и участия мелатонина в этом процессе было проведено количественное определение мелатонина в теле личинок шпорцевой лягушки и в основных мелатонинсекретирующих органах (эпифизарный комплекс, латеральные глаза и желудочно-кишечный тракт) методом тандемной масс-спектрометрии, сопряженной с ультраэффективной жидкостной хроматографией в процессе регенерации пигментной системы после ее локального разрушения. Показано, что динамика изменения содержания гормона коррелирована во всех мелатонинсодержащих органах и в теле личинки. Выявлен подъем уровня гормона в начальный период после операции по разрушению меланофоров, причем интенсивность восстановления пигментной системы соответствовала более высокому содержанию мелатонина в теле личинок на белом фоне на 2 день после операции, что согласуется с полученными ранее данными по чувствительности процесса регенерации к добавлению экзогенного гормона именно в эти сроки. Таким образом, 2-й день после операции является гормон-зависимым периодом, во время которого мелатонин проявляет эффект, стимулирующий репарационный процесс. Методом привитой сополимеризации исследовали in vitro возможность участия СР-реакций в процессах метилирования ДНК (совместно со ст.н.с. Института геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН А.А. Ивановым). Получили предварительный положительный результат: изменения уровня радиоактивного индикатора радикальной сополимеризации при добавлении метилазы к препарату ДНК указывает на появление свободнорадикальных состояний. Показано, что инкубация зародышей вьюна Misgurnus fossilis с момента оплодотворения во вращающемся магнитном поле (магнитная индукция 200 Гс ) влияет на жизнеспособность и темп эмбрионального развития зародышей. При 6, 10 и 20 Гц ВМП наблюдается достоверное (р ≤ 0,01) снижение смертности в группах и ускорение развития зародышей. Дальнейшее увеличение частоты вращения замедляет развитие и повышает гибель зародышей в группах до 100%. Степень проявления влияния ВМП зависит от исходного качества икры. Было изучено действие электромагнитного излучения КВЧ-диапазона (7,1 мм) на клеточные культуры с разными морфогенетическими потенциями: культуры клеток HeLa, HaCaT и МСК. Проведено сравнение действия непрерывного излучения (4 мВт/см2) и импульсного (8 Гц, 2 мВт/см2) на указанные культуры. В качестве критериев оценки действия излучения учитывали изменение числа клеток. Показаны специфические различия в реакции клеточных линий на излучения одного типа. После непрерывного излучения обнаружено достоверное увеличение числа клеток МСК (на 20% по сравнению с контрольной группой), замедление роста культуры HeLa (на 16%), в культуре HeLa достоверной реакции не обнаружено. Импульсное излучение приводило к ускорению роста числа клеток HaCaT (на 54%), снижению роста числа HeLa (на 40%), в культуре МСК достоверного изменения числа клеток обнаружено не было. Полученные результаты позволили выдвинуть предположение о большей чувствительности более дифференцированных делящихся клеток к излучению КВЧ. Показано, что изменения изотопного состава углерода находят отклик в морфологических и функциональных проявлениях организмов. Так, обогащение тяжелым стабильным изотопом углерода (при культивировании в фотобиореакторе в среде, насыщенной 13СО2) приводит к увеличению объема автоспор и ускоряет в 1,1 раза темпы умножения Chlorella vulgaris в сравнении с таковом при культивировании с природным СО2 (98,9% 12С, 1,1% 13С). Культивирование в 12СО2, напротив, существенно сокращает объем автоспор и замедляет темпы умножения клеток (в 0,64 раза в сравнении с контролем). Выявлено, что содержание нескольких последовательных поколений Daphnia magna на хлорелле, обогащенной 13С и 12С, приводит к существенному сокращению репродуктивности (числа овуляций, численности овулировавших яиц и числа успешно развивающихся зародышей) и продолжительности существования когорт второго и третьего поколений. В третьем и четвертом поколениях эти показатели восстанавливаются до уровня, сопоставимого с контрольными когортами (т.е. культивировавшихся на хлорелле, выращенной на природном углекислом газе). Фазическое снижение плодовитости существенно более выражено в когортах, содержавшихся на изотопно-легкой хлорелле. Предположено, что описанные выше проявления живых существ связаны с модификациями метаболизма, привносимыми магнитным изотопным эффектом тяжелого изотопа углерода.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Исследование механизмов дифференцировки и интеграции дифференцирующихся систем в развитии животных как основа совершенствования медицинских технологий.
Результаты этапа: Сохранность биологического материала при криоконсервации –ключевая проблема криобиологии, и, как конкретное практическое приложение, интенсификации методов ЭКО. Проведена модификация метода Куваямы для криоконсервации ооцитов мыши. Модификация коснулась последовательности насыщения диметилсульфоксидом ооцитов мыши и полной заменой в криопротекторном растворе сывороточного альбумина на фиколл. В отличие от метода Куваямы насыщение клеток криопротекторами (этиленгликоль и ДМСО) проводили не одновременно, а последовательно: сначала выдерживали ооциты в 7,5% этиленгликоле на среде (5 мин), а затем присоединяли к раствору ДМСО 7,5% (еще 5 мин). При этом удалось полностью исключить гибель ооцитов в результате токсического воздействия диметилсульфоксида. В рамках исследования ранних этапов оогенеза и фолликулогенеза методом количественного ПЦР анализа (ПЦР в реальном времени) была изучена экспрессия генов основных участников сигнального каскада Hippo (MST1, LATS ½ и Yap) в эмбриональных яичниках мышей (Е14,5-17,5). Было показано, что наибольший уровень экспрессии наблюдается на 16,5 сутки внутриутробного развития. Повышение уровня экспрессии исследуемых генов наблюдается непосредственно перед началом фрагментации гетерогенных овариальных цист и массовой гибели женских половых клеток. Иммуноцитохимическое окрашивание криостатных срезов эмбриональных яичников мыши выявило колокализацию флуоресцентного сигнала, соответствующего белкам LATS ½ и YAP, и каспаз 3/7 в зонах скопления соматических клеток. Наибольшая интенсивность флуоресцентных сигналов была обнаружена на срезах яичников 16,5 и 17,5 суток эмбрионального развития. В ходе настоящего исследования с применением метода количественной ПЦР в режиме реального времени был проведён анализ уровней экспрессии ряда генов, отвечающих за инициацию мейотического созревания в ооцитах, полученных в результате культивирования in vitro овариальных фолликулов мыши. Так, было показано, что уровень экспрессии таких генов как Epab (отвечающего за синтез одноименного белка, обеспечивающего регуляцию уровня трансляции в ооцитах), а также гена Ccnh (кодирующего субъединицу САК-комплекса, который отвечает за активацию MPF-комплекса) существенно ниже (показаны статистически значимые различия) по сравнению с ооцитами, полученными из мышей in vivo. В то же время проведённое исследование по генам Mos (начальный член МАРК-каскада), Wee2 (регулятор MPF-комплекса), Cdk1 и Ccnb (гены, кодирующие белки, являющиеся компонентами MPF-комплекса) показало отсутствие статистически значимых различий в уровнях экспрессии в ооцитах, полученных в результате культивирования овариальных фолликулов in vitro и ооцитов, выделенных из мышей in vivo. Одной из ключевых проблем клеточной заместительной терапии дисфункций опорно-двигательного аппарата и миодистрофий остается доступность аутологичных источников клеточного материала, способного дифференцироваться в миогенном направлении. Уникальное онтогенетическое происхождение и способность к бесфиброзной репарации большинства ран ротовой полости делает клетки десны одним из перспективных источников аутологичного клеточного материала. Было проведено изучение стромальных клеток альвеолярной слизистой оболочки десны человека в 3D условиях культивирования. В условиях 3D культуры из стромальных клеток десны за 7сут за счет агрегации клеток в первые сутки и последующей компактизации формировались компактные сфероиды. В составе сформированных сфероидов обнаружили две области: поверхностную и центральную. Клетки поверхностной области имели уплощенную форму, плотно прилегали друг к другу, клетки центральной области были округлыми, между ними постепенно накапливался внеклеточный матрикс. В сфероидах из стромальных клеток альвеолярной слизистой оболочки десны показали индуцированную и спонтанную дифференцировку клеток в миогенном направлении с образованием миофибрилл с характерным расположением ядер по периферии и поперечной исчерченностью, выявляемой окрашиванием антителами к белку саркомерному α-актинину. С применением современных методов лазерной микрохирургии клеточных сфероидов разработана новая простая воспроизводимая модель с целью изучения механизмов репарации и регенерации in vitro. Для этого с помощью наносекундного лазерного скальпеля провели микродиссекцию поверхностной и внутренней зон сфероидов из эпителиальных клеток, мезенхимных клеток и дермальных фибробластов. Уже в течение первого часа после воздействия на сфероиды лазерным излучением форма выживших после повреждения клеток изменялась - клетки на поверхности сфероида и непосредственно в области повреждения становились округлыми. Через сутки после микродиссекции структура сфероидов начинала частично восстанавливаться, клетки в поверхностных слоях начинали принимать исходную уплощенную форму, дебрис из погибших поврежденных клеток и их фрагментов постепенно исключался из состава сфероида. Восстановление структуры сфероидов с несколькими поверхностными слоями уплощенных черепицеобразно расположенных клеток и полигональными клетками внутренней зоны происходило для всех проанализированных культур без пролиферации за счет ремоделирования выживших клеток. При разработке новой модели, позволяющей проследить сочетание клеточных и организменных уровней в процессе регенерации, проведено сравнение компетенций различных зон поверхности тела личинки шпорцевой лягушки Xеnopus laevis к восстановлению пигментных клеток (меланофоров) после их локальной утраты в результате механического повреждения стеклянным зондом. На седьмой день после повреждения в области между головным мозгом фронтальным глазом восстановления пигментации не наблюдается. В области между головным мозгом и ноздрями появление единичных новых меланофоров наблюдали только у 1/3 оперированных животных. На участках каудальнее и вентральнее глаз регенерация пигментной системы идет интенсивно - число клеток на седьмой день превышает число разрушенных, новые меланофоры мельче и расположены плотнее, чем меланофоры до операции. Прослежено, что на участках интенсивного восстановления пигментной системы повреждение единичных меланофоров компенсируется за счет изменения формы и размеров прилежащих к месту повреждения пигментных клеток, новые клетки не появляются в стандартных временных границах эксперимента. Прослежено влияние КВЧ-излучения на регенерацию пигментной системы покровов личинок шпорцевой лягушки Xеnopus laevis. Установлено, что 30-ти минутное облучение личинок после локального разрушения меланофоров (длина волны 7.1 мм, непрерывная модуляция, мощность 4 мВ/см2) приводило к резкому угнетению последующего восстановлении пигментации. После облучения через 9 дней на месте поражения облученных личинок восстанавливается не более 30 процентов от прежнего числа клеток, тогда как у личинок контрольной группы восстанавливается 90-110% пигментных клеток) Установлено, что степень влияния вращающегося магнитного поля (магнитная индукция 200 Гс ) на ранних зародышей вьюна Misgurnus fossilis зависит от исходного качества икры. 20-ти часовая инкубация в условиях ВМП с момента оплодотворения зародышей, развивающихся из икры высокого качества (выживаемость в контроле 90,1±2,64 %), не влияет на выживаемость зародышей при частотах 6, 10 и 20 Гц или снижает выживаемость его до 41,2±2,14 % при 30 Гц, до 28,3±1,44 % при 35 Гц и приводит к 100% гибели эмбрионов при ВМП 50, 75 и 100 Гц. При снижении качества икры (выживаемость в контроле 35,2±1,65%) ВМП достоверно (р ≤ 0,01) снижают выживаемость зародышей до 6,1 ± 0,32% при 30 Гц и до 100% гибели при действии 35, 50 или 100 Гц, но достоверно (р ≤ 0,01) повышает выживаемость до 54 – 63 % при 20, 10 и 6 Гц. Инкубация в условиях ВМП оказывает влияние и на темп эмбрионального развития, причем степень проявления эффекта не зависит от исходного качества икры. Под действием ВМП с частотой вращения 6 и 10 Гц наблюдается четкое увеличение темпа развития, при 20 Гц ВМП стимуляция ускорения развития резко уменьшается, а при 30 Гц ВМП, наоборот, на фоне повышения смертности зародышей в группе наблюдается легкое торможение темпа эмбрионального развития по сравнению с соответствующими контрольными группами. Прослежена динамика люцигенин-зависимого сверх-слабого излучения (ЛЗ-ССИ) планарий, регистрируемого с помощью оcнащенного фотоумножителем люминометра Биотокс-7а, на ранних сроках регенерации после (1) одной поперечной перерезки на уровне антериорной четверти или после (2) троекратных перерезок (на уровне антериорной четверти, перед глоткой и на уровне постериорной четвери по антерио-постериорной оси планарии). Всплеск ЛЗ-ССИ наблюдали сразу после перерезки, затем в течение примерно 2–4 часов уровень ЛЗ-ССИ снижался до уровня излучения интактного животного, а через 10–12 часов после перерезки наблюдали второй всплеск ЛЗ-ССИ, по времени соответствующий пику митотической активности необластов (стволовых клеток планарии), обеспечивающих репарацию раны. Уровень второго пика, регистрируемого от животных после троекратной перерезки, более, чем в 2 раза превышал таковой при однократной перерезке. Т.о. показана прямая корреляция пика ЛЗ-ССИ со степенью травмирования животных, что прямо связано с числом пролиферирующих необластов. Продолжается исследование in vitro методом привитой сополимеризации возможности участия СР-реакций в процессах метилирования ДНК (совместно со ст.н.с. Института геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН А.А. Ивановым). Получили предварительный положительный результат: при добавлении к препарату ДНК метилазы изменение уровня радиоактивного индикатора радикальной сополимеризации указывает на наличие свободнорадикальных состояний.
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Исследование механизмов дифференцировки и интеграции дифференцирующихся систем в развитии животных как основа совершенствования медицинских технологий.
Результаты этапа: В рамках исследования участия сигнального каскада Hippo в ранних этапах оогенеза млекопитающих были уточнены ранее полученные данные, касающиеся экспрессии генов- участников сигнального каскада MST1, LATS1/2 и Yap методом ПЦР в реальном времени в эмбриональных яичниках мышей (стадии Е14,5-18,5). Была подобрана система культивирования эмбриональных яичников мыши in vitro, а также выбраны концентрации ингибиторов (вертепорфина и XMU-MP-1) и время инкубации яичников в растворе ингибитора. Состояние овариальной ткани после культивирования в ингибиторах и состояние яичников из группы контроля оценивали по морфологическим признакам при исследовании гистологических срезов образцов. Были проведены исследования уровней экспрессии ряда генов, ответственных за созревание ооцита (Mos, Epab, Ccnh, Cdk1, Ccnb, Wee2) в условиях in vitro и in vivo. Было показано, что в ооцитах на стадии GV уровни экспрессии генов, кодирующих белки MPF-комплекса (Cdk1, Ccnb), а также Wee2, не различаются в ооцитах, выделенных из фолликулов, культивированных in vitro в подобранных условиях, и в ооцитах, полученных из яичников половозрелых и неполовозрелых мышей. Также было показано, что уровни экспрессии генов Epab и Ccnh в ооцитах, выделенных из фолликулов, культивированных in vitro, достоверно ниже таковых в ооцитах, выделенных из яичников от половозрелых и неполовозрелых мышей. Уровни экспрессии гена Mos, ответственного за протекание мейоза и митоза, достоверно ниже в ооцитах, полученных от неполовозрелых мышей, по сравнению с половозрелыми. Бластоцисты мыши линии С57BL подвергали криоконсервации в средах, содержащих криопротекторы диметилсульфоксид и этиленгликоль. Насыщение криопротекторами проводили при различных температурах (+8°С, +25°С, +37°С). Показано, что критическое значение имеет температура последнего витрификационного раствора, содержащего высокую концентрацию ДМСО (15%). Установлено, что выживаемость бластоцист является эквивалентной при выдерживании в течение 40 сек при 37° С, 60 сек - при 25°С и 180 сек - при 8°С. В рамках изучения лазерного воздействия на преимплантационные эмбрионы млекопитающих при проведении микрохирургических процедур с использованием лазерных систем были проведены эксперименты по разрезанию и гравировке (нанесению кода) zona pellucida преимплантационных эмбрионов мыши при помощи фемтосекундного лазера. Было показано, что выбранные режимы и длительности лазерного воздействия не снижают жизнеспособность эмбрионов и не оказывают влияние на скорость пролиферации клеток и их количество в составе эмбриона. Показано, что мультипотентные мезенхимные стромальные клетки, выделенные из стромы десны человека (ММСК), в 3D культуре образуют сфероиды, клетки которых спонтанно и при индукции средой DMEM с пониженным содержанием глюкозы и с добавлением 2% сыворотки крови лошади через 7 сут дифференцировались в миогенном направлении с формированием миофибрилл с характерным периферическим расположением ядер и поперечной исчерченностью. Миофибриллы окрашивались антителами к белкам миозина и саркомерного α-актинина. Кроме того, для анализа миогенного потенциала сфероидов in vivo была разработана модель трансмиокардиальной инъекции и проведены пилотные эксперименты по терапии вызванного изопротеренолом инфаркта миокарды сфероидами из ММСК. Проведена лазерная микродиссекция сфероидов из мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) из различных источников – костного мозга, лимба глаза, десны. Показано, что для всех типов сфероидов из ММСК восстановление формы поверхностной зоны и ее механических свойств (модуль Юнга) происходили через сутки после микродиссекции. Полное восстановление структуры сфероидов с несколькими поверхностными слоями уплощенных черепицеобразно расположенных клеток и полигональными клетками внутренней зоны происходило без пролиферации за счет ремоделирования выживших клеток. Продолжилась работа с новой регенерационной моделью - восстановление популяции пигментных клеток в дерме личинок шпорцевой лягушки Xеnopus laevis после локального повреждения. Были установлены возраст-зависимый механизм регенерации, возникновение отклонений в процессе перестройки пигментной системы в течение преметаморфоза с выраженной динамикой отставания в следствии интенсивной пролиферативной активности премеланобластов. Последняя особенность была установлена только в зоне каудальнее глаз. Прослежено, что у личинок на поздних стадиях развития после повреждения единичных меланофоров отсутствует компенсаторное увеличение пигментации покровов за счет изменения формы и размеров соседних меланофоров, прилежащих к месту повреждения клеток, и новые клетки не появляются в стандартных временных границах эксперимента. С помощью метода регистрации люцигенин зависимой хемилюминисценции исследована динамика уровня активных форм кислорода в процессе регенерации планарий Dugesia tigrina. Показано, что пик свечения, отмечаемый через 10-12 час после операции и связанный с активной пролиферацией «ранозаживляющих» необластов, является чувствительным параметром для регистрации внешних воздействий. Установлено, что электромагнитное излучение и добавление ряда регуляторных пептидов (fMLP и апоцинин) изменяют амплитуду сигнала. В работе на клеточных линиях HaCaT (иммортализованные кератиноциты человека) и А431 (эпидермоидная карцинома человека) с помощью ряда методик проведено изучение последствий воздействия электромагнитного излучения крайне высокой частоты (КВЧ) и ультрафиолетового диапазона (УФ). После облучения УФ показана корреляция локализации интенсивности автофлуоресценции с окрашиванием флуоресцентным зондом на синглетный кислород (SOSG). Также проведено изучение указанных клеточных линий с помощью метода FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy), анализируются различия между культурами и между облученными и контрольными группами. Показана возможность применения акустооптических устройств для исследования локальной гетерогенности желтка у эмбрионов вьюна Misgurnus fossilis. Представлены данные, полученные при помощи акустооптического видеоспектрометра. Проводили непрерывную прижизненную регистрацию изображений зародыша в оптическом диапазоне 450 ÷ 750 нм в течение 1 ч (цикл прохода по диапазону 2 мин.) при переходе эмбрионов с 32-й на 33-ю стадию развития. Проведен анализ спектров колебаний оптической плотности в 4 областях желточного мешка зародыша: в антериорной, средней и постериорной, а также в вентральной части, непосредственно не сообщающейся с зародышем. Для каждой из областей выявлены как специфические закономерности изменения кинетики поглощения в зависимости от длины волны, так и некоторая их синхронизация, что может указывать на согласованность определенных процессов, происходящих в разных областях желточного мешка зародыша. С целью проследить эволюцию онтогенезов проведен анализ особенности жизненных циклов (разнообразие жизненных форм и сроков их существования, способов репродукции, эмбрионального и личиночного развития и регенераторной способности) в сравнительном ряду организмов
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Исследование механизмов дифференцировки и интеграции дифференцирующихся систем в развитии животных как основа совершенствования медицинских технологий.
Результаты этапа: Исследования методом ПЦР в реальном времени (qPCR) подтвердили предварительные данные о динамике экспрессии генов сигнального каскада Hippo (MST1, LATS1/2 и Yap) в яичниках эмбрионов мышей на стадиях (Е14,5-18,5). причем наибольший уровень экспрессии наблюдается на 16,5 сутки внутриутробного развития непосредственно перед формированием ооцитов I порядка. Методом Western blot прослежено содержание соответствующих белков в яичниках эмбрионов мышей и выявлено, что в эмбриональных яичниках преобладает нефосфорилированная форма белка YAP (максимум на стадии Е16,5), а также отсутствует фосфорилированная форма белков LATS1/2. Полученные результаты косвенны образом свидетельствуют либо об отсутствии активности, либо о сниженной активности сигнального каскада Hippo в эмбриональных яичниках Бластоцисты мыши линии С57BL, извлеченнные из матки, подвергали криоконсервации в средах, содержащих криопротекторы диметилсульфоксид (2,7М), этиленгликоль (2,1М), сахарозу (0,5М), а также различные высокомолекулярные соединения (полисахароза, гидроксипропилцеллюлоза и альбумин). Установлено, что при использовании высоких скоростей замораживания и оттаивания (более 20 тыс. К/мин) все высокомолекулярные соединения одинаково эффективно обеспечивают выживаемость эмбрионов. При низких скоростях оттаивания (2-20 тыс К/мин) полисахароза обеспечивает большую выживаемость эмбрионов мыши. Установлено, что частичная диссекция фемтосекундным лазером zona pellucida (ZP) бластоцист мыши на эмбриональных или абэмбриональных полюсах приводит к повышению процента хетчинга по сравнению с интактными бластоцистами (93,3-94,7% против 83,3-85,7% соответственно). Скорости имплантации in vivo и частота имплантации эмбрионов после проведения частичной диссекции ZP сопоставима с таковой в контрольной группе (92,3% против 95,4%), что свидетельствует об отсутствии травмирования эмбриона в местах проведения микродиссекции ZP. Показано, что сфероиды из мультипотентных мезенхимных стромальных клеток лимба (ММСКЛ) содержали большое количество внеклеточного матрикса по сравнению со сфероидами из клеток ретинального пигментного эпителия (КРПЭ), у которых внеклеточный матрикс практически отсутствовал. Исследование механический свойств сфероидов показало, что сфероиды из ММСКЛ по модулю Юнга были в 2.3 раза прочнее, чем сфероиды из КРПЭ. Слияние сфероидов из ММСКЛ шло медленнее (48 чсов), чем из сфероидов из КРПЭ, что вероятно, связано с ремоделированием внеклеточного матрикса. Установлено, что модель слияния липидных капель, не учитывающая структурно-механические характеристики, не применима к слиянию клеточных сфероидов Мультипотентные мезенхимных стромальных клеток в 2D и 3D условиях культивирования подвергали облучению . в красном (633нм, 1200сек, 20000Дж/м2) и инфракрасном диапазонах (840нм, 600сек, 20000Дж/м2) с помощью облучателей СДМ-07 (LDM-07), разработанных в Институте фотонных технологий РАН. Установлено, что на интактные 2D культуры облучение не оказывает влияния, но стимулирует метаболизм в клетках культур, подвергшихся воздействию ротенона (ингибитора электронтранспортной цепи в митохондриях) - скорость потребления кислорода клетками увеличивается на 15-20%. В 3D культурах при формировании тканеинженерных конструкций фотобиомодуляция иммобилизованных в фибриновый гидрогель клеток увеличивает их метаболическую и пролиферативную активность, что косвенно указывает на угнетенное состояние клеток условиях 3D культур в норме. На культуре клеточной линии НаСаТ (иммортализованные кератиноциты человека) подтверждена колокализация внутриклеточных сайтов автофлуоресценции и окрашивания с помощью зонда на синглетный кислород (флуоресцентная краска SOSG) после УФ облучения культуры. На предложенной ранее модели регенерации планарии Dugesia tigrina продолжено исследование влияния ингибиторов (apocynin - ингибитор про-оксидативного фермента NADPH-оксидазы ) и активаторов (УФ- и КВЧ-облучение, пептид fMLP) интенсивности люцигенин-зависимой хемилюминисценции регенерирующей ткани на динамику регенерации.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".