|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Изучение особенностей структурной организации центров связывания в ферментах патогенов и разработка новых антибиотиков для лечения заболеваний нижних дыхательных путей с использованием системных подходов биоинформатики и молекулярного моделированияНИР
Study of structural features of enzyme binding sites in pathogenic organisms and design of novel antibiotics to treat lower respiratory tract infections using systematic methods of bioinformatics and molecular modeling
- Руководитель НИР: Швядас В.К.
- Ответственные исполнители: Нилов Д.К., Суплатов Д.А., Щербакова Т.А.
- Участники НИР: Балдин С.М., Гущина И.В., Дробот В.В., Кирилин Е.М., Шарапова Я.А., Шмальгаузен Е.В.
- Подразделение: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского
- Срок исполнения: 12 апреля 2018 г. - 31 декабря 2019 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 15-14-00069-П
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Структура и функции биологических макромолекул и макромолекулярных комплексов. Биокатализ.
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
-
Рубрики ГРНТИ:
- 31.23.25 Антибиотики
- 31.27.15 Структура и функции биополимеров
- 31.27.17 Энзимология
- 31.27.19 Биохимия микроорганизмов
- 31.27.22 Антимикробные агенты
- 31.27.25 Биохимия животных
- 34.57.21 Материалы для биомедицинского применения
- 62.39.51 Ферменты и ферментативные процессы в науке, технике и промышленности
-
Описание:
Проект ставит своей целью развитие и оптимизацию нового комплексного подхода к борьбе с инфекционными заболеваниями. Оригинальная комплексная методология, использующая возможности биоинформатического анализа и молекулярного моделирования, основы которой были разработаны авторским коллективом в 2015-2017 гг., будет использована для поиска эффективных ингибиторов для подавления активности ключевых ферментов возбудителей инфекций дыхательных путей (пневмонии и туберкулеза): транскетолазы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, L,D-транспептидазы и нейраминидазы. Перспективность идеи по выявлению и использованию ранее неизвестных функционально важных участков связывания в структуре ферментов патогенов для создания комплементарных им селективных ингибиторов в качестве прототипов новых антибиотиков была доказана на первом этапе выполнения проекта в 2015 -2017 гг. Задачей проекта на данном этапе является выяснение функциональной роли ранее неизученных сайтов связывания лигандов, а также установление механизма действия ингибиторов, связывающихся в таких сайтах и способных избирательно подавлять рост патогенов. Будут изучены особенности структурной организации различных участков связывания в ферментах патогенных микроорганизмов, установлены различия между ранее неизученными функционально важными участками в гомологичных ферментах человека и патогенов, оптимизирована методология поиска соединений, способных избирательно связываться на этих участках в ферментах патогенов и селективно подавлять рост патогенных бактерий. Последовательность и сущность этапов разрабатываемой методологии принципиально отличается от подходов, используемых в большинстве других лабораторий, основанных на «слепом» скрининге огромных библиотек химических и природных соединений при помощи экспериментальных роботов или компьютерном скрининге соединений по их способности связываться в активном центре фермента. Разрабатываемый подход является универсальным и может быть использован в дальнейшем для поиска селективных ингибиторов широкого круга ферментов различных семейств. В данном проекте внимание сосредоточено на поиске селективных ингибиторов ферментов, связанных с разными этапами жизнедеятельности патогенных микроорганизмов: организацией клеточных стенок, энергетического обеспечения путем гликолиза и пентозофосфатного пути, важнейшими для роста и выживания процессами транскрипции, а также механизмом формирования биопленок – одного из способов колонизации патогена. Выбор конкретных ферментов на данном этапе обусловлен необходимостью научного анализа и описания конкретных примеров для представления научной базы разрабатываемой методологии. Работая с выбранным кругом ферментов авторский коллектив «в одних руках» может провести согласованную проверку и оптимизацию разрабатываемого подхода и подробно представить результаты в научных публикациях: от компьютерных стадий биоинформатического анализа суперсемейств ферментов и молекулярного моделирования фермент-лигандных и фермент-субстратных взаимодействия, до экспериментальной проверки ингибиторных свойств отобранных кандидатов и сравнительного изучения гомологичных ферментов. В результате выполнения широкому кругу пользователей будет представлена доступная методология, которая позволяет использовать доступные веб-серверы и разработанные нами программы. Научные публикации объяснят суть методологии на конкретных примерах. Привлекательность методологии заключается в том, что мы предлагаем существенно сократить процесс дизайна новых лекарственных препаратов и увеличить его продуктивность за счет внедрения эффективных компьютерных стадий по нахождению ранее неизвестных участков связывания новых лекарственных кандидатов и отбору наиболее перспективных селективных лигандов (ингибиторов), комплементарных этим сайтам, что во много раз снижает потребность в трудоемких экспериментальных стадиях синтеза библиотек с избыточным количеством веществ и массового скрининга ингибиторных свойств потенциальных кандидатов. Возможности разрабатываемого подхода не ограничиваются конкретными задачами данного проекта, предлагаемая методология может быть использована для создания более широкого круга лекарственных препаратов, основанных на селективном ингибировании отдельных представителей семейства гомологичных ферментов или белков.
-
Abstract:
The project aims to develop and optimize an original complex approach to combat infectious diseases. The original integrated methodology, based on the bioinformatic analysis and molecular modeling, which was developed by our team in 2015-2017, will be used to search for effective inhibitors of the activity of the key enzymes from pathogens of human respiratory tract infections (pneumonia and tuberculosis): transketolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, L,D-transpeptidase and neuraminidase. The benefits of the idea of identifying and using previously unknown functionally important binding sites in the structure of pathogenic enzymes to create complementary selective inhibitors as prototypes of new antibiotics was demonstrated at the first stage of the project in 2015 -2017. The objective of the project at this stage is to elucidate the functional role of previously unexplained ligand binding sites, as well as to determine the mechanism of action of inhibitors binding at such sites and capable of selectively inhibiting the growth of pathogens. Features of structural organization of different binding sites in enzymes from pathogenic microorganisms will be studied, differences between previously unexplored functionally important sites in homologous enzymes from humans and pathogens will be studied, and a methodology for searching for complementary compounds capable of selectively binding at these sites in enzymes of pathogens and selectively inhibiting the growth of pathogenic bacteria will be optimized. The core of our methodology is fundamentally different from the approaches used in most other laboratories based on the "blind" screening of huge libraries of chemical and natural compounds by means of experimental robots or by computer screening of compounds for their ability to bind in the active center of the enzyme. The developed approach is universal and can be used in the future to search for selective inhibitors of a wide range of enzymes of different families. In this project, attention is focused on the search for selective enzyme inhibitors associated with different stages of vital activity of pathogenic microorganisms: the organization of cell walls, energy supply through glycolysis and the pentose phosphate pathway, essential for growth and survival by transcription processes, as well as the mechanism of biofilm formation - one of the methods of pathogen colonization. The choice of specific enzymes at this stage is due to the need for scientific analysis and the description of specific examples for presenting the scientific base of the developed methodology. Working with the chosen range of enzymes, our team “in one hand” can carry out a coordinated check and optimization of the developed approach and present the results in scientific publications in detail: from computer stages of bioinformatic analysis of enzyme superfamilies and molecular modeling of enzyme-ligand and enzyme-substrate interactions, to experimental evaluation of inhibitory properties of selected candidates and comparative study of homologous enzymes. As a result, a comprehensive methodology will become available to a wide range of users via public web-servers and original programs. Scientific publications will explain the essence of methodology on specific examples. The attractiveness of the methodology lies in the fact that we propose to significantly reduce the cost of the design of new drugs and increase its productivity by introducing effective computer-based steps to find previously unknown binding sites for new drug candidates and selecting the most promising selective ligands (inhibitors) complementary to these sites that will provide an opportunity to reduce the need for labor-intensive experimental stages of synthesizing large libraries with an excessive amount of substances and massive screening of inhibitory properties of potential candidates. The possibilities of the approach being developed are not limited to the specific tasks of this project, the proposed methodology can be used to create a wider range of drugs based on selective inhibition of individual members of the family of homologous enzymes.
-
Планируемые результаты:
В результате выполнения проекта будет проведена оптимизация нового подхода к борьбе с инфекционными заболеваниями, методологической основой которого является комплексное использование возможностей системной биологии, биоинформатического анализа, молекулярного моделирования и высокопроизводительных вычислений, что во много раз снижает потребность в трудоемких экспериментальных стадиях синтеза библиотек с избыточным количеством веществ и массового скрининга ингибиторных свойств потенциальных кандидатов. С использованием разработанной методологии будут получены оригинальные соединения-ингибиторы ферментов бактериальных инфекций нижних дыхательных путей (пневмонии и туберкулеза): транскетолазы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, L,D-транспептидазы и нейраминидазы, являющиеся прототипами новых антибиотиков. Суть подхода заключается в следующем: на первом этапе исследования определяется круг функционально важных участков связывания в структуре ферментов (в том числе ранее неизученных или малоизученных участков), проводится отбор наиболее функционально важных участков, выявляются особенности организации таких функционально важных участков (в том числе активных и аллостерических центров) в структурах выбранных ферментов патогенных микроорганизмов по сравнению с другими ферментами суперсемейства, в том числе ферментами человека и животных. С использованием методов биоинформатического анализа и молекулярного моделирования проводится характеристика ранее неизученных участков связывания в структуре выбранных ферментов, их распределение по функциональной значимости, выявляются наиболее перспективные участки для связывания потенциальных ингибиторов. Определяются аминокислотные остатки, определяющие природу и специфичность связывания на отобранных участках. С учетом этой информации при помощи методов молекулярного моделирования проводится дизайн ингибиторов, комплементарных выбранным участкам связывания в ферментах патогенных микроорганизмов. С использованием различных подходов молекулярного моделирования (как разработанных в нашей лаборатории ранее, так и наиболее эффективных методов, описанных в литературе) создаются фокусированные in silico библиотеки потенциальных ингибиторов выбранных ферментов. Важным этапом исследования при разработке структурной модели самого фермента является учет особенностей механизма действия конкретного фермента (на основе литературных данных, а также результатов молекулярного моделирования) и состояния ионогенных групп аминокислотных остатков, участвующих в каталитическом механизме, а также формирующих участки связывания потенциальных ингибиторов. В результате компьютерного скрининга in silico библиотек с использованием построенных молекулярных моделей ферментов отбираются наиболее перспективные соединения для экспериментального получения и исследования ингибиторных свойств. В результате выполнения проекта в 2018 -2019 гг. эффективность методологии будет проверена на примерах конкретных ферментов бактериальных патогенов (пневмонии и туберкулеза): транскетолазы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, L,D-транспептидазы и нейраминидазы. Будет выяснена функциональная роли ранее неизученных сайтов связывания лигандов в этих ферментах, установлен механизм действия ингибиторов, связывающихся в таких сайтах и способных избирательно подавлять рост патогенов. Будут изучены особенности структурной организации различных участков связывания в ферментах патогенных микроорганизмов, установлены различия между ранее неизученными функционально важными участками в гомологичных ферментах человека и патогенов, оптимизирована методология поиска соединений, способных избирательно связываться на этих участках в ферментах патогенов и селективно подавлять рост патогенных бактерий. Последовательность и сущность этапов разрабатываемой методологии принципиально отличается от подходов, используемых в большинстве других лабораторий, основанных на «слепом» скрининге огромных библиотек химических и природных соединений при помощи экспериментальных роботов или компьютерном скрининге соединений по их способности связываться в активном центре фермента. Разрабатываемый подход является универсальным и может быть использован в дальнейшем для поиска селективных ингибиторов широкого круга ферментов различных семейств. Выбор конкретных ферментов на данном этапе обусловлен необходимостью научного анализа и описания конкретных примеров для представления научной базы разрабатываемой методологии. Работая с выбранным кругом ферментов авторский коллектив «в одних руках» проведет согласованную проверку и оптимизацию разрабатываемого подхода и представит результаты в научных публикациях: от компьютерных стадий биоинформатическогоанализа суперсемейств ферментов и молекулярного моделирования фермент-лигандных и фермент-субстратных взаимодействия, до экспериментальной проверки ингибиторных свойств отобранных кандидатов и сравнительного изучения гомологичных ферментов. В результате выполнения проекта широкому кругу пользователей будет представлена доступная методология, которая позволяет использовать доступные веб-серверы и разработанные нами программы. Научные публикации объяснят суть методологии на конкретных примерах. Привлекательность методологии заключается в том, что мы предпредлагаем существенно сократить процесс дизайна новых лекарственных препаратов и увеличить его продуктивность за счет внедрения эффективных компьютерных стадий по нахождению ранее неизвестных участков связывания новых лекарственных кандидатов и отбору наиболее перспективных селективных лигандов (ингибиторов), комплементарных этим сайтам, что во много раз снижает потребность в трудоемких экспериментальных стадиях синтеза библиотек с избыточным количеством веществ и массового скрининга ингибиторных свойств потенциальных кандидатов. Возможности разрабатываемого подхода не ограничиваются конкретными задачами данного проекта, предлагаемая методология может быть использована для создания более широкого круга лекарственных препаратов, основанных на селективном ингибировании отдельных представителей семейства гомологичных ферментов или белков. Ожидаемые результаты будут соответствовать мировому уровню, по отдельным показателям опережать мировой уровень, и представлять большой практический интерес для создания новых антибиотиков. Полученные результаты внесут существенный вклад в решение ключевой проблемы научного приоритета по созданию новых лекарственных средств и решению социальных задач борьбы с инфекционными заболеваниями.
-
Научный задел:
Разработан комплексный подход, использующий возможности системной биологии, биоинформатики, молекулярного моделирования, теоретической химии, и высокопроизводительных вычислений, для поиска и характеристики участков связывания в структуре ферментов, оценки их функциональной значимости. Методология реализована в виде он-лайн платформы, состоящей из 4-х серверов: Mustguseal, visualCMAT, Zebra и pocketZebra, (https://biokinet.belozersky.msu.ru/mustguseal; https://biokinet.belozersky.msu.ru/visualcmat; https://biokinet.belozersky.msu.ru/zebra и https://biokinet.belozersky.msu.ru/pocketzebra). Платформа представляет возможность применения биоинформатических методов через относительно простой веб интерфейс для изучения структурного и функционального разнообразия ферментов, поиска и аннотации новых центров связывания в их структурах. Ключевой веб-сервер Mustguseal позволяет автоматически строить выравнивания больших суперсемейств белков с использованием всей информации об их структурах и последовательностях в публичных базах данных. Mustguseal позволяет не только выравнивать, но и собирать выборку структурно и функционально разнообразных родственных белков из публичных баз данных (PDB, UniProtKB/SwissProt, UniProtKB/TrEMBL), строить большие выравнивания семейств/суперсемейств белков, состоящих из тысяч структур и последовательностей гомологов. Веб-сервер visualCMAT позволяет идентифицировать коррелирующие/ко-эволюционирующие позиции во множественном выравнивании суперсемейства и анализировать их с использованием структурной информации о гомологах. Серверы Zebra и pocketZebra позволяют определять специфические позиции подсемейств в структуре ферментов/белков, изучать и классифицировать различные участки связывания в их структуре. Сформирован также эталонный набор белков с аннотированными каталитическим и аллостерическим сайтами в их структурах, названный CASBench (от Catalytic and Allosteric Sites Benchmarking set). https://biokinet.belozersky.msu.ru/casbench.
- Добавил в систему: Швядас Витаутас-Юозапас Каятоно
Источник финансирования НИР
| грант РНФ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 12 апреля 2018 г.-15 декабря 2018 г. | Изучение особенностей структурной организации центров связывания в ферментах патогенов и разработка новых антибиотиков для лечения заболеваний нижних дыхательных путей с использованием системных подходов биоинформатики и молекулярного моделирования |
| Результаты этапа: В 2018 году с использованием разработанных ранее методов Mustguseal, pocketZebra, visualCMAT было продолжено изучение новых участков связывания и механизма действия комплементарных им ингибиторов в структурах ферментов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ и нейраминидаз/сиалидаз из различных источников (в том числе патогенных организмов, высших млекопитающих и человека). Ключевую роль в нашей работе продолжает играть использование суперкомпьютера. Для эффективного применения суперкомпьютерной системы при решении задач молекулярного моделирования и биоинформатического анализа мы продолжаем использовать оригинальное программное обеспечение, в том числе в 2018 году была разработана новая программа parMATT для построения множественного выравнивания сотен и тысяч трехмерных структур гомологичных белков. Использование суперкомпьютерной системы позволяет вывести сравнительный биоинформатический анализ суперсемейств ферментов на новый уровень с точки зрения объема информации и масштабов ее обработки, повысить производительность и точность скрининга больших библиотек потенциальных ингибиторов – прототипов лекарственных препаратов. На данном этапе развития энзимологии становится общепринятым, что белок в растворе представляет не жесткую структуру, а ансамбль структурных конформеров, существующих в динамическом равновесии, и, вероятно, обладающих разными свойствами. В марте 2018 года началась эксплуатация нового раздела научной установки суперкомпьютера Ломоносов-2 МГУ, который базируется на графических ускорителях NVidia Pascal P100. Использование этой мощной вычислительной архитектуры позволило нам выйти на качественно новый уровень понимания конформационной пластичности и особенностей структурной организации функционально важных участков связывания в ферментах, открыть и изучить ранее неизвестные участки связывания анализируя существенно более длинные траектории молекулярной динамики порядка 500 – 1000 нс. На основе результатов биоинформатического анализа 28677 последовательностей и структур ГАФД и ГАФД-подобных белков было выявлено в общей сложности 15 уникальных (т.е. присутствующих в каждой цепи тетрамера) сайтов связывания в ГАФД микобактерий и человека. Обнаружение с использованием биоинформатического анализа в структурах ГАФД целого ряда участков связывания косвенно подтверждают так называемые мунлайтинговые свойства этого фермента, т.е. множественность функциональных свойств. ГАФД является одним из наиболее ярких представителей этой группы белков, проявляя в разных условиях более десятка разнообразных свойств, при реализации которых могут быть задействованы разные участки структуры; обнаружение ранее неизвестных сайтов связывание при использовании методов биоинформатики и молекулярного моделирование может быть полезным инструментом исследования механизмов мунлайтинга. Описанные сайты были проранжированы в соответствии с присутствием в их структурах специфических и ко-эволюционирующих позиций, поскольку ранее было показано, что присутствие позиций этих двух типов характерно для участков связывания лигандов, имеющих функциональное или регуляторное значение. На основе анализ всей доступной информации о структурах и последовательностях суперсемейства ГАФД и ГАФД-подобных белков отобраны наиболее перспективные участки связывания. Проведенный анализ 664 структур гомологов с использованием нового программного обеспечения parMATT позволяет утверждать, что выбранные сайты присутствуют в структурах всех ГАФД, что говорит об их важности для выполнения этими белками их физиологических функций, однако отсутствуют в структурах их далеких гомологов с другими функциями. В 2018 году были изучены возможности создания ингибиторов, способных селективно связываться в выбранных участках, проведен in silico скрининг библиотеки коммерчески доступных лигандов, отобраны только такие лиганды с наилучшей оценкой энергии связывания, структура которых оптимальна для взаимодействия со специфическими позициями в структуре соответствующего сайта в ферменте патогена, что позволяет выявить структуры селективных модуляторов его активности, не оказывающие влияния на другие гомологичные ферменты суперсемейства, в том числе фермент человека. Молекулярное моделирование позволило описать механизмы действия новых ингибиторов ГАФД, отобранных в этом году, а также соединений, предложенных в прошлом году и уже продемонстрировавших (по результатам экспериментальных исследований) способность селективно ингибировать ГАФД из микобактерий, а также подавлять рост возбудителя туберкулеза. Наличие специфических позиций в отобранных сайтах, которые отличаются в человеке и микобактериях, объясняет селективность распознавания обнаруженных ингибиторов только бактериальным ферментом. Показано, что потенциал оригинальных методов аннотации новых сайтов в структурах ферментов (Mustguseal, pocketZebra, visualCMAT) оказался шире, чем ранее предполагалось, и разрабатываемый комплексный подход способен детектировать даже такие сайты, которые скрыты в кристаллографических структурах ферментов, но становятся доступными для связывания лигандов в результате динамических изменений в структуре белка. Была продолжена работа по биоинформатическому анализу структуры бактериальной нейраминидазы А (NanA) из Streptococcus pneumoniae, начатая в 2017 г. В 2018 году были проведены дополнительные эксперименты по белок-белковому докингу и изучению подвижности структур нейраминидаз. Полученные результаты частично опубликованы: Sharapova Y., Suplatov D., Švedas V.//The FEBS journal. 2018. https://doi.org/10.1111/febs.14486. С использованием методов биоинформатики, гомологичного моделирования и молекулярной динамики показано, что в NanB и NanC лектиновый и каталитический домены формируют жесткую глобулу, стабилизированную множественными междоменными взаимодействиями, в то время как в NanA домены пространственно обособлены, несмотря на связанность междоменным линкером из 16 аминокислот. Проведенные в 2018 году исследования белок-белкового докинга позволили описать уникальную структурную организацию NanA пневмококка, изучение которой будет продолжено в 2019 году. Проведенные в 2018 году исследования показали, что изучение структурно-функциональных взаимосвязей в NanA и поиск селективных ингибиторов ее активности представляет не только фундаментальный, но и практический интерес. Для изучения участков связывания в структурах бактериальных и вирусных нейраминидаз было построено структурно-опосредованное множественное выравнивание соответствующих ферментов и их гомологов из различных бактериальных источников и вирусных штаммов. Были определены консервативные аминокислотные остатки, а также специфические позиции, т.е. эквивалентные участки структур нейраминидаз, которые заняты разными типами аминокислотных остатков в ферментах из вирусов и патогенных бактерий. Консервативные позиции преимущественно локализованы в области активного центра рассмотренных ферментов и представляют интерес в контексте разработки ингибиторов двойного действия, способных подавлять активность обоих ферментов. Специфические позиции, напротив, интересны как механизм распознавания ингибиторов, селективных к каждому ферменту по-отдельности. В отчетном году подробно исследовали структурную организацию открытого нами ранее перспективного участка связывания в вирусных нейраминидазах N1 и N2. Соответствующий участок образован как консервативными, так и вариабельными аминокислотами, расположен по соседству с другим функционально важным участком связывания и представляет перспективную мишень для создания селективных ингибиторов широкого спектра действия. Компьютерный скрининг библиотеки из 300 тыс. соединений в активные центры моделей нейраминидаз N1 и N2 позволил отобрать наиболее перспективные 492 соединения с широкой селективностью для последующего изучения. Также представляет интерес исследование возможностей избирательного и не избирательного ингибирования бактериальной и вирусной нейраминидаз. В отчетном году была изучена селективность ингибиторов, идентифицированных для каждой из этих мишеней. Потенциальные ингибиторы нейраминидазы из S. pneumoniae докировали в активный центр моделей вирусных нейраминидаз N1 и N2. В полученных комплексах не наблюдали взаимодействий, которые были описаны нами как критически важные для распознавания ингибиторов, что позволяет сделать вывод о селективности данных соединений в отношении бактериальной нейраминидазы. В свою очередь, потенциальные ингибиторы вирусных нейраминидаз N1 и N2 были докированы в активный центр бактериальной нейраминидазы NanA, была показана их способность образовывать ключевые взаимодействия, таким образом эти соединения могут быть универсальными ингибиторами как вирусной, так и бактериальной нейраминидазы. Важным как для понимания патогенного действия, так и для поиска средств борьбы с вирусом гриппа является выяснение механизма взаимодействия нейраминидазы с природными и синтетическими субстратами этого фермента. Определение конформационных состояний гликанового рецептора в процессе его гидролиза нейраминидазой позволило бы создать специфические критерии отбора ингибиторов-аналогов переходного состояния с низким риском вирусной резистентности. В 2018 году с использованием расширенных форм молекулярной динамики, включая метадинамику и ускоренную молекулярную динамику было проведено молекулярное моделирование взаимодействия нейраминидазы гриппа с фрагментом гликанового рецептора клеточной мембраны. В качестве модели природного субстрата использовали трисахарид. Было показано, что для субстрата в растворе в свободном состоянии характерно два кластера, отличающихся друг от друга преимущественно значением первого дигедрального угла, а при связывании в активном центре нейраминидазы наборы конформаций субстрата существенным образом отличаются – т.е. конфигурация субстрата в комплексе с ферментом существенно отличается от его конфигурации в растворе. Описана структура реакционноспособного фермент-субстратного комплекса. Новое понимание конформационных состояний субстрата в активном центре фермента является важным для дизайна эффективных ингибиторов и будет использовано для дальнейшей оптимизации ингибиторов нейраминидаз, отобранных в этом году. В 2018 г. проведены выделение, очистка и биохимическая характеристика транскетолазы из M. tuberculosis, изучены каталитические свойств и стабильность фермента, определены оптимальные условия для хранения препаратов очищенного фермента и экспериментального тестирования активности потенциальных ингибиторов. Определена эффективность связывания с тиаминдифосфатом, показано, что константа связывания зависит от природы иона металла. Обнаружено, что при хранении в холодильнике раствора голоформы транскетолазы из M. tuberculosis в течение недели активность фермента практически не изменяется, однако при замораживании при -18 °С происходит частичная потеря активности (около 20%). Из-за относительно низкого сродства к кофактору и недостаточной стабильности апофермент в разбавленных растворах теряет способность эффективно восстанавливать активность при добавлении кофакторов, причем такое поведение не типично для транскетолаз из других источников (например, для фермента человека). Добавление в систему бычьего сывороточного альбумина (1 мг/мл) стабилизирует транскетолазу из M. tuberculosis и обеспечивает полное восстановление активности как в случае как с Mg2+, так и с Ca2+. Получено необходимое количество очищенного ферментного препарата и отработана методика определения способности низкомолекулярных соединений ингибировать активность транскетолазы из M. tuberculosis. Разработанную методику использовали в 2018 году для изучения влияния потенциальных ингибиторов на транскетолазу из M. tuberculosis (ранее для этого использовали модельный фермента из дрожжей). На предыдущих этапах проекта был идентифицирован класс соединений-ингибиторов транскетолазы из M. tuberculosis. В 2018 г. проведен компьютерный скрининг 4 млн коммерчески доступных соединений этого типа в активный центр модели транскетолазы из M. tuberculosis и по эффективности молекулярных взаимодействий выбраны три новых ингибитора. Экспериментально изучено влияние на транскетолазу из M. tuberculosis трех новых ингибиторов, а также 11 соединений, выявленных на предыдущих этапах проекта. Обнаружено, что наиболее эффективный ингибитор в концентрации 150 мкМ полностью подавляет ферментативную активность. Значение IC50 было определено при варьировании концентрации и составило 7 мкМ. Проверка противотуберкулезной активности обнаруженных ингибиторов показала их способность подавлять рост возбудителя туберкулеза. Для защиты результатов интеллектуальной деятельности по обнаружению ингибиторов транскетолазы из M. tuberculosis, обладающих противотуберкулезной активностью, подана заявка на патент. При проведении патентных исследований и поиска по базам данных медицинских и биологических публикаций было установлено, что обнаруженные нами соединениями являются первыми ингибиторами транскетолазы из M. tuberculosis. До последнего времени единственным классом соединений, способным необратимо ингибировать L,D-транспептидазы из M. Tuberculosis, являются карбапенемы. В связи с этим поиск новых эффективных ингибиторов L,D-транспептидаз патогенов является актуальной задачей. Были выбраны новые соединения – потенциальные ингибиторы фермента, и впервые проведен их синтез, описаны соответствующие методики, выход целевых продуктов, а также масс-спектры синтезированных соединений. Другой важной задачей года было молекулярное моделирование взаимодействия L,D-транспептидаз из M. tuberculosis с потенциальными ингибиторами. Для этой цели были построены высокоточные молекулярные модели выбранных лигандов с использованием методов квантово-химического моделирования и теоретической химии. Анализ траектории длительностью 1мкс показал существенные конформационные переходы в активном центре фермента, динамический анализ поверхности фермента выявил три основных участка связывания потенциальных ингибиторов. Была получена структура фермента с открытой конформацией «крышки» активного центра для дальнейшего моделирования образования комплекса с лигандами и подбора новых ингибиторов. | ||
| 2 | 9 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Изучение особенностей структурной организации центров связывания в ферментах патогенов и разработка новых антибиотиков для лечения заболеваний нижних дыхательных путей с использованием системных подходов биоинформатики и молекулярного моделирования |
| Результаты этапа: В 2019 году был осмыслен и обобщен опыт по разработке и использованию нашего подхода по созданию новых методов поиска селективных ингибиторов ферментов, основой которого является комплексное использование возможностей биоинформатического анализа, молекулярного моделирования и высокопроизводительных вычислений. Важное значение в нашей работе имело использование суперкомпьютера. На данном этапе развития энзимологии становится общепринятым, что белок в растворе представляет не жесткую структуру, а ансамбль структурных конформеров, существующих в динамическом равновесии, и, вероятно, обладающих отличающимися свойствами. Информация о конформационной пластичности и особенностях структурной организации функционально важных участков связывания в ферментах критически важна для изучения механизмов их взаимодействия как с субстратами, так и с лигандами/модуляторами и может быть учтена двумя способами: (1) с использованием молекулярного моделирования для изучения набора конформеров, а также (2) с использованием биоинформатического анализа для сравнения всех доступных 3D-структур самого белка и его гомологов. Оба способа являются ресурсозатратными и требуют разработки новых решений, учитывающих особенности современных задач компьютерной биологии, в том числе, экспоненциальный рост объемов информации в биоинформатических базах данных. Для эффективного применения суперкомпьютерной системы при решении задач молекулярного моделирования и биоинформатического анализа мы продолжали разрабатывать оригинальное программное обеспечение. В 2019 году была опубликована новая программа parMATT для построения множественного 3D-выравнивания белков на суперкомпьютере, которая представляет собой гибридную MPI/pthreads/OpenMP параллельную реализацию алгоритма MATT и позволяет выравнивать сотни и тысячи структур белков при использовании вычислительных систем с распределенной памятью, то есть вычислительных кластеров и суперкомпьютеров. Это открывает новые возможности, поскольку база данных UniProtKB уже содержит 180 миллионов записей об аминокислотных последовательностях белков, а база данных PDB демонстрирует почти экспоненциальный рост числа их пространственных структур. Использование parMATT при выполнении задач проекта позволило сравнивать белки как с их структурными вариациями, полученными из молекулярной динамики (для сравнения 3D-вариантов одного белка предусмотрен специальный режим работы программы), а также анализировать большие выборки, состоящие из нескольких десятков и сотен 3D-структур белков, для получения информации об особенностях структурной организации как ранее известных, так и пока не изученных центров/мишеней действия ингибиторов, а также выбора конформеров для докинга белок-лиганд и белок-белок. Использование parMATT позволило нам выйти на качественно новый уровень понимания роли динамической структуры белков в проявлении их функциональных свойств, открыть и изучить, например, динамическое поведение ранее неизвестных участков связывания в результате анализа существенно более длинных траекторий молекулярной динамики порядка 500–1000 нс, а также повысить производительность и точность скрининга больших библиотек потенциальных ингибиторов – прототипов лекарственных препаратов. С использованием разработанной методологии был продолжен поиск оптимальных структур соединений-ингибиторов ферментов бактериальных инфекций нижних дыхательных путей (пневмонии и туберкулеза) и связанных инфекций (гриппа): транскетолазы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, L,D-транспептидазы, бактериальной и вирусной нейраминидазы как прототипов новых антибиотиков и противовирусных препаратов. Проведена оптимизация структуры ингибиторов транскетолазы и L,D-транспептидазы, конструирование ингибиторов нового типа (бифункциональных ингибиторов) бактериальной и вирусной нейраминидазы, исследованы возможности создания ингибиторов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, ориентированных на открытый ранее участок связывания (pocket4). Выяснен молекулярный механизм участия нейраминидазы A из Streptococcus pneumoniae - связанного с клеточной стенкой модульного фермента в формировании биопленок пневмококка. С использованием молекулярного моделирования и биоинформатического анализа была описана уникальная пространственная организация каталитического и лектинового доменов в структуре NanA. Показано, что в отличие от гомологичных сиалидаз, два домена в одной молекуле NanA не образуют жесткую глобулу и разделены в пространстве гибким линкером из 16 аминокислот. Каталитический и лектиновый домены, принадлежащие двум разным молекулам фермента, могут взаимодействовать через ранее неизвестный интерфейс, образуя комплекс, стабилизированный сетью межмолекулярных водородных связей и солевых мостиков, таким образом приводя к межмолекулярным связям и агрегации. На предыдущем этапе проекта мы констатировали важность двух областей активного центра нейраминидаз – участка сиаловой кислоты и так называемой полости-430 – для связывания потенциальных ингибиторов. Это создает предпосылки для создания бифункциональных соединений, связывание которых затрагивает оба участка. Поиск ингибиторов нейраминидазы NanA проводили при помощи компьютерного скрининга библиотеки сульфонамидов, для которых на предыдущем этапе была показана возможность взаимодействия с аргининовой триадой нейраминидаз. Обнаружено, что сульфонамиды располагаются на участке сиаловой кислоты, атом азота ориентирован в сторону полости-430 и может участвовать в образовании водородных связей с молекулами воды. Моно- и дизамещенные сульфонамиды были способны располагаться в двух возможных ориентациях. Проведенное моделирование показало, что сульфонамидная группа способна образовать важные водородные связи в активном центре нейраминидаз на границе участка сиаловой кислоты и полости-430. Для проверки гипотезы о возможности использования сульфонамидной группы в качестве подходящего линкерного фрагмента было проведено моделирование взаимодействия фермента с соединениями, которые могли бы являться «полноценными» бифункциональными ингибиторами нейраминидаз. При конструировании молекулы такого «полноценного» бифункционального ингибитора два структурных фрагмента: один, способный связываться на участке сиаловой кислоты, и другой, способный связываться в полости-430, соединяли сульфонамидным линкером. Была создана компьютерная библиотека производных с различными вариантами линкера, полученные молекулы докировали в активный центр нейраминидаз N1, N2 и NanA, что позволило установить оптимальную структуру линкера. На основании результатов проведенного молекулярного моделирования и компьютерного скрининга сделан вывод о том, что создание бифукциональных ингибиторов, состоящих из структурных фрагментов, комплементарных участку связывания сиаловой кислоты, а также полости-430 и соединенных сульфонамидным линкером, принципиально возможно. Поскольку устройство активных центров и полости-430 в нейраминидазах N1/N2 и NanA имеет определенные различия, можно создавать ингибиторы с необходимой селективностью. В 2019 году был изучен pocket4 – последний из шести наиболее статистически достоверных потенциальных участков связывания в структуре микобактериальной ГАФД, показано, что он представляет замкнутую изолированную полость, расположенную в толще структуры белка и не пригодную для связывания ингибиторов. С использованием разрабатываемого подхода, а также с учетом требований медицинской химии по растворимости, селективности действия и токсичности, была проведена оптимизация структуры ингибиторов транскетолазы из M. tuberculosis путем введения солюбилизирующих заместителей в разветвленную алифатическую группу, ориентируемую в сторону раствора при связывании ингибитора в активном центре. Внесенные модификации практически не оказывали влияния на эффективность связывания и положение ингибитора. QSAR-моделирование токсикологических свойств наиболее эффективных ингибиторов транскетолазы осуществляли с использованием программы ACD/Percepta (www.acdlabs.com) на основе экспериментальных данных для похожих по структуре соединений. Обнаруженные ингибиторы не содержали генотоксичных фрагментов, маловероятно их связывание с рецептором эстрогена альфа (нет риска репродуктивной токсичности), калиевым каналом hERG (нет риска кардиотоксичности), обратным транспортером Р-гликопротеином и ферментами семейства цитохрома P450. Моделирование связывания L,D-транспептидазы 2 Mycobacterium tuberculosis с фрагментами природного субстрата было проведено с использованием метадинамики. Целью исследования была характеристика взаимодействия LdtMt2 и фрагментов природного субстрата с заряженными или амидированными группами: γ-D-Glu(COO-/CONH2) и m-Dap(COO-/CONH2). Проведенное моделирование показало лучшее связывание фермента с амидированным субстратом, в то время как связывание субстрата, содержащего карбоксильные группы, в активном центре LdtMt2 не было энергетически выгодным. Взаимодействие фермента с субстратами двух типов было также исследовано на наличие предреакционных событий – NAC (near-to-attack conformation) в состояниях системы, когда переходное состояние еще не сформировано, но атомы, между которыми произойдет образование химической связи, приближены друг к другу на расстояние, равное сумме их Ван-дер-Ваальсовых радиусов. В случае амидированого субстрата наблюдали большее число NAC событий по сравнению с карбоксилированным, что свидетельствует о предпочтительном ферментативном превращении амидированного субстрата, что согласуется с экспериментальными данными других авторов [Ngadjeua F. et al. Critical Impact of Peptidoglycan Precursor Amidation on the Activity of L,D‐Transpeptidases from Enterococcus faecium and Mycobacterium tuberculosis, Chemistry. A European Journal. 2018, 24(22), 5743-5747] по синтезу поперечных сшивок в клеточной стенке патогена. В 2019 году был проведен поиск новых ингибиторов LdtMt2. Молекулярный скрининг проводили с использованием методов молекулярной динамики и виртуального скрининга. Библиотека соединений для скрининга состояла из более чем 1.73 млн. соединений, которые отвечали следующим критериям: наличие в структуре паттернов β2-гомотреонина с активированной карбоксильной группой (эфиры, амиды, пептиды) для возможности ацилирования каталитического остатка Cys354 LdtMt2, мезо-диаминопимелиновой кислоты c активированными карбоксильными группами, циклические дипептиды (дикетопиперазины), соединения, содержащие в своей структуре β-лактамное ядро и соединения класса сульфаниламидов, как одни из наиболее распространенных структур, мимикрирующих переходное состояние. При кластеризации структур каталитического домена LdtMt2 из кадров МД траектории, были отобраны 2 структуры, которые использовали при скрининге наряду с кристаллографической структурой LdtMt2 (PDB ID: 3TUR), из которой был предварительно удален остаток природного субстрата. К результатам проведенного докинга были применены 2 механизма фильтрации по энергетическим и геометрическим критериям. В конечном итоге были отобраны 24 соединения, при экспериментальной проверке были обнаружены вещества, проявляющие ингибиторные свойства в концентрациях ниже 100 мкМ. Оценочные значения KI для наиболее эффективных ингибиторов составили 14 и 8 мкМ. Следует отметить, что данные ингибиторы были найдены в результате фильтрации результатов скрининга библиотеки лигандов по отношению к структуре фермента, полученной в результате молекулярного моделирования, в то время как докинг в кристаллическую структуру (PDB ID: 3TUR) не указал на их способность ингибировать LdtMt2. Наиболее значимыми научными результатами работы в 2019 г. можно считать следующие: публикацию статьи в журнале Bioinformatics, посвященную разработке программы parMATT для построения множественного 3D-выравнивания белков на суперкомпьютере, которая позволила проводить биоинформатический анализ больших суперсемейств белков/ферментов, исследовать особенности структурной организации как ранее известных, так и пока не изученных центров/мишеней действия ингибиторов; установление молекулярного механизма участия нейраминидазы А из Streptococcus pneumoniae в формировании биопленок пневмококка за счет образования межмолекулярных агрегатов при взаимодействии каталитического и лектинового доменов, принадлежащих двум разным молекулам фермента; установление принципов конструирования селективных бифункциональных ингибиторов бактериальных и вирусных нейраминидаз; разработку адекватных молекулярных моделей L,D-транспептидазы 2 из Mycobacterium tuberculosis, выяснение факторов, определяющих эффективность взаимодействия фермента с природными субстратами и внешними лигандами; установление функциональной роли ранее неизвестных участков связывания лигандов в структуре глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы микобактерий. Наиболее практически значимыми результатами работы в 2019 г. можно считать: Получение патента на применение фурансульфонатов – первых ингибиторов для подавления активности транскетолазы и роста бактерий Mycobacterium tuberculosis; обнаружение новых ингибиторов L,D-транспептидазы 2 из Mycobacterium tuberculosis. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".