ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Подсемейство Allioideae (Amaryllidaceae) включает четыре трибы, к одной из которых относится род Allium, который является одним из крупнейших родов мировой флоры (около 780 видов) и представлен тремя эволюционными линиями. Его представители произрастают в Северном полушарии, среди них довольно большое количество редких и эндемичных видов, а также целый ряд экономически важных растений (в т. ч. A. sativum, A. cepa, A. fistulosum, A. schoenoprasum). Многие виды Allioideae в процессе эволюции смогли успешно приспособиться к выживанию в неблагоприятных для сельскохозяйственной деятельности условиях, в т.ч. ксерофитных сообществах высокогорий и полупустынь. Некоторые, напротив, не выходят из тени широколиственных лесов. Адаптация растений к произрастанию в экологических нишах проявляется в виде целого спектра морфолого-физиологических признаков, что находит отражение на генетическом уровне. Процессы адаптивной эволюции происходят не только в ядерном геноме, но и затрагивают геном хлоропластов, в котором содержатся пулы генов, связанных с основной функцией растения - фотосинтезом. Это касается видов, приспособившихся к произрастанию в местообитаниях, отличающихся по степени освещенности, спектру освещения, средним температурам и значениям температурных экстремумов в вегетационный период. Размер хлоропластного генома намного меньше ядерного, сравним с небольшим бактериальным геномом. Несмотря на экономическую важность рода Allium в настоящее время в GenBank опубликованы последовательности лишь двух видов рода (A. sativum и A. cepa). Также не известно ни одной полной последовательности пластома других родов семейства. В ходе предварительных работ мы получили (и частично охарактеризовали) полные последовательности пластомов нескольких дикорастущих видов Allium. В настоящей работе мы планируем произвести анализ эволюции пластомов Allium, относящихся к разным секциям трех основных эволюционных линий рода, а также секвенирование и сравнительный анализ пластомов представителей других триб Allioideae (в частности, Tulbaghia, Tristagma, Nothoscordum etc.). Также будет проведено секвенирование пластома нескольких видов Amaryllidoideae (аутгруппа). В результате будут выявлены черты (делеции/инсерции генов, инверсии), отличающие пластом Allium трех эволюционных линий друг от друга, а также от иных родов Allioideae. Также будут установлены и охарактеризованы участки пластома Allium, отличающиеся наибольшей скоростью накопления мутаций. В результате популяционного анализа пластомов нескольких Allium, адаптировавшихся к разным экологическим нишам, будут идентифицированы гены, а также не кодирующие участки пластома растений рода Allium, находящиеся под воздействием естественного отбора.
Allium, one of the largest genera of flora (it includes about 780 species, comprising 3 lineages), it belongs to Allioideae (Amaryllidaceae). Allium species inhabit northern hemisphere, some of them are rare and endemic, some of them are economically significant (A. sativum, A. cepa, A. fistulosum, A. schoenoprasum). Many species of Allium are adapted to contrast environments, including dry highlands and deserts, while other abundant in shadow wide-leaved forests. Environmental adaptations are provided by wide range of morphologic and physiologic traits, based on specific genomic features. Adaptive evolution goes not only in nuclear genome but also in plastome especially in of photosystems I and II genes. Species, adapted to contrasting environments (that are, differing in sunlight intensity, sunlight spectrum, average and extremal temperatures in vegetation period), should have signatures of selection in their plastomes. Despite the significant economic value of Allium genus, only two plastome sequences (A. sativum and A. cepa) are published in GenBank, no full plastome sequence of the other Alliaceae genera are published either. We obtained full sequences of some wild Allium species plastomes in our preliminary work and partly annotated them. During the proposed project we plan to analyze plastome evolution in three main evolutionary linages of Allium genus, obtain sequences of the other Allioideae tribes (of Tulbaghia, Tristagma, Nothoscordum genera) and perform comparative analysis to reveal genomic traits (gene deletions/insertions, region invertions), differing plastome of three Allium lineages from each other and from other genera of Allioideae. We plan also to sequence plastome of at least some species of Amaryllidoideae (as outgroup). We plan to determine and characterize Allium plastome regions with the highest mutation accumulation rate. Population analysis of some Allium species, adapted to different habitats, will provide us an opportunity to identify genes and non-coding plastome regions, undergoing natural selection pressure.
В результате выполнения проекта мы планируем: (1) Установить последовательности и провести филогенетический анализ пластомов для ряда видов семейства Amaryllidaceae, в частности: для видов Allium, относящихся к разным секциям трех основных эволюционных линий рода, нескольких других родов семейства, относящихся к трибам Tulbaghieae, Gilliesieae, Leucocoryneae (в т.ч. Tulbaghia, Tristagma, Nothoscordum). Установить характерные генетические черты (инсерции/делеции генов, некодирующих участков), отличающие пластом Allium от иных родов семейства. Выявить макроэволюционные события, происходившие в процессе эволюции рода Allium (в частности, мы предполагаем, что делеция одного из генов пластома (infA) характерна для всех видов, относящихся ко второй эволюционной линии). Также мы предполагаем, что выявленные нами в ходе предварительных работ крупные перестройки в пластоме A. paradoxum (третья эволюционная линия) – не характерны для видов той же эволюционной линии. (2) У видов Allium, адаптировавшихся к произрастанию в различных экологических нишах, в том числе: высокогорий (на примере видов, собранных на высотах более 2800 м, Тянь-Шань); полупустынь (окрестности оз. Иссык-Куль, полупустыни внутренней Монголии, Каратау (Казахстан), Копетдаг, Хамадан, Табриз (Северный Иран); влажных тенистых лесов и открытых участков лесостепей и степей (тенелюбивые виды) европейской территории РФ: - установить и охарактеризовать участки пластома, отличающиеся наибольшей скоростью накопления мутаций.¬¬ - выявить гены, а также некодирующие участки пластома, находящиеся под воздействием положительного/отрицательного естественного отбора Результаты работы будут вкладом в фундаментальную науку, в понимание генетических основ адаптации высших растений к условиям обитания. В перспективе полученные результаты могут быть использованы для создания новых сортов, пригодных для культивирования в районах, не относящихся сейчас к зонам земледелия.
В ходе ранее проведенных работ были отработаны методы выделения фракции хлоропластной ДНК из растений разных видов, что важно, поскольку использование такого подхода позволяет существенно сократить стоимость секвенирования одного образца. Получена de novo информация о последовательностях ряда пластомов видов растений рода Allium (до публикации данные представлены на www.chloroplast.ru), а также данные секвенирования пластомов от нескольких образцов из двух популяций A.semenovii, из одной популяции A. platyspatum (растения были собраны в разных ущельях одного района). Для A. platyspatum имеется материал, собранный на еще одном перевале. Собраны растения из двух географически разнесенных популяций A.flavum (Воронежская область) и двух популяций A.ursinum (Тульская область, Алтай). Был проведен предварительный анализ пластомов некоторых видов луков, который выявил ряд особенностей платома у некоторых видов Allium. Собран в природе материал, необходимый для проведения филогенетического анализа (в Иране, Казахстане, Монголии) или получен от коллег из других научных учреждений, в том числе от ведущих специалистов по систематике луков Серегина А.П. (МГУ им. М.В, Ломоносова), Friesen N. (Германия), а также из Новосибирского ботанического сада. Показано, что у видов луков, отличающихся экологическми условиями естественных обитаний (широкоареальные, культивируемые и тенелюбивые) выявляется дифференциальная экспрессия некоторых генов пластома, связанных с фотосинтезом (ycf3), а также заметно различаяется физиологическая реакция на воздействие повышенной температуры окружающей среды.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 5 февраля 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Эволюция пластомов у растений подсем. Allioideae, адаптировавшихся к обитанию в различных экологических нишах |
Результаты этапа: Было проведено сравнение полных последовательностей хлоропластных геномов видов рода Allium, отсеквенированных нами ранее: Allium paradoxum (M. Bieb.) G.Don, A. fistulosum L., A. cepa L., A. schoenoprasum L., A. platyspathum Schrenk, A. obliquum L., A. nutans L., A. sativum L., A. macleanii Baker, A. victorialis L., A. zebdanense Boiss. & Noë, A. pskemense B.Fedtsch. и A. ursinum L. Сравнительный анализ показал, что пластом A. paradoxum заметно отличается от пластомов других видов рода. Наиболее заметные отличия заключаются в наличии инверсии длиной 4825 б.п. (регион между генами ndhE и rpl32) в малом однокопийном повторе, а также в полной утрате или псевдогенизации всех NADH-генов. Было показано, что из-за большого количества небольших делеций пластом A. paradoxum является самым коротким из известных пластомов видов рода Allium, его длина составляет всего 145 819 п.н. Было установлено, что в пластоме A. paradoxum произошла дефункционализация всех генов NADH-дегидрогеназного комплекса (ndh гены), что, предположительно, связано с адаптацией данного вида растения к произрастанию в определенных экологических условиях (тенистые влажные леса). Также в хлоропластном геноме A. paradoxum, в отличие от остальных исследованных пластомов, делетирован ген rpl22. Пластом A. ursinum (вида, относящегося к той же (первой) эволюционной линии, что и A. paradoxum), напротив, был значительно больше похож на пластомы видов, относящихся ко второй и третьей эволюционным линиям. В нем не было найдено ни крупных перестроек, ни значительных расхождений в количестве генов. Пока что остается неясным, является ли пластом A. paradoxum исключением, или аналогичные эволюционные события обнаружатся также в пластомах его близких родственников из той же секции Briseis. По этой части результатов подготовлена статья (“Gene”, на рассмотрении рецензентов) У других видов рода Allium была обнаружена делеция еще ряда генов: ген infA отсутствует у A. victorialis и A. macleanii. Потеря этого гена из хлоропластного генома ранее была отмечена и других родов растений (Millen RS, Olmstead RG, Adams KL, et al., Many parallel losses of infA from chloroplast DNA during angiosperm evolution with multiple independent transfers to the nucleus. Plant Cell. 2001 Mar;13(3):645-58.) У этих же изученных нами видов луков (A. victorialis и A. macleanii), а также у A. macleanii, наоборот, присутствует ген psaC, которого не было отмечено в пластомах других изученных видов рода Allium. У видов A. platyspathum, A. obliquum, A. schoenoprasum была обнаружена делеция гена rps16. Дефункциализация гена rps16, вплоть до полной его потери из хлоропластного генома, была показана и для других групп высших растений (например, 10.1093/dnares/dsx006). На основании анализа полученных расчетных данных были установлены участки пластомов видов рода Allium, которые отличаются скоростью накопления мутаций (см. таблицу в приложении 1). К ним относятся практически все гены и межгенные спейсеры малого однокопийного участка пластома (SSC), причем стоит отдельно отметить высокую скорость эволюции генов и межгенных спейсеров рядом с границами с инвертированными повторами: гены rps15 и ycf1_2 на стыке SSC и IRa (rate=2,44 и 3, соответственно) и ycf1 и rpl32 на границе SSC и IRb (rate=3,05 и 5,5, соответственно). В самих инвертированных повторах повышенная скорость эволюции (rate=1-1.2) была отмечена для единичных открытых рамок считывания (orf42 в обоих повторах, orf56 в IRa), а также для гена ycf15, расположенного в IRb. Невысокая скорость эволюции (1.53) была отмечена только в одном межгенном спейсере: rpl2_4-trnH2. В большом однокопийном регионе пластома (LSC) максимальная скорость эволюции была показана для генов trnS, rps32, psaI и infA (rate=2.7-4.9). Последние два (psaI и infA) участвуют в адаптации растений к стрессовым условиям. Достаточно высокая (rate=2.03-2.4) скорость эволюции оказалась у генов matK, rps16, psbI и petG, Повышенная скорость эволюции последовательности гена matK отмечалась в работах многих авторов (например, Khidir W. Hilu and Michelle M. Barthet (2008) Mode and Tempo of matK: Gene Evolution and Phylogenetic Implications Evolutionary Biology from Concept to Application, Chapter 10). Продукт гена psbI участвует в стабилизации антенны фотосистемы II и участвует в адаптации организма к стрессовым факторам, в том числе и с повышенным уровнем освещенности (10.1104/pp.107.107805, doi: 10.1074/jbc.M604888200). Поэтому его высокая скорость эволюции также может быть связана с адаптацией растений к стрессовым факторам. Продукт гена petG участвует в сборке комплекса цитохромов (Berthold DA, Schmidt CL, Malkin R. The deletion of petG in Chlamydomonas reinhardtii disrupts the cytochrome bf complex. J Biol Chem. 1995 Dec 8;270(49):29293-8.), причем его отсутствие (вместе продуктами генов PetL и PetN) приводит к увеличению чувствительности растений к свету (doi: 10.1104/pp.107.100131) Повышенная скорость эволюции в области LSC (rate=1.02-1.86) также была отмечена для межгенных спейсеров: psbA-trnH, rps16-trnK2, trnQ-rps16, psbi-psbK, atpA-trnR, rpoC2-rps2, trnT-trnL1, trnL2-trnF, ycf4-cemA, petA-psbJ, petD-rpoA. Большая часть из них используется для установления филогенетического родства между разными видами растений. С похожей скоростью эволюционируют гены, кодирующие ATP synthase (atpE, atpA, atpF, atpI), белки, участвующие в сборке фотосистемы II (psbB, psbF, psbI, psbH, psbJ, psbM), гены, кодирующие большие (rpl14, rpl 20, rpl 22, rpl 33, rpl 36) и малые (rps 3, rps 8, rps 12-exon2) субъединицы рибосом, РНК полимеразы (rpoA, rpoC2, rpoC1 exon1), цитохром (petL). Часть 2 Основной целью проекта является поиск генов, а также некодирующих участков генома, которые находятся под воздействием отбора у видов Allium, адаптировавшихся к жизни в экстремальных условиях. Для решения конкретной задачи, связанной с эволюцией пластомов растений, относящихся к роду Allium, необходимо понимать основные пути эволюции пластома растений, входящих в подсем. Allioideae относительно эволюции пластома семейства Amaryllidaceae в целом. Это позволит отличить нейтральные события эволюции пластома у рода Allium (например, делеции генов или некодирующих участков), от особенностей, возникших в результате давления отбора. Таким образом, для решения указанной конкретной подзадачи вполне допустимо использовать растения, которые интересны с точки зрения анализа эволюции последовательностей пластомов семейства. Поэтому было запланировано провести секвенирование пластомов видов растений, относящихся к родам Tulbaghia, Amaryllis, Nothoscordum, Tristagma и Gilliesia. За отчетный период было проведено секвенирование хлоропластных геномов Tulbaghia ludwigiana Harv., Amaryllis belladonna L. и Nothoscordum bivalve (L.) Britton. Пластомы видов растений, относящихся к родам Tristagma и Gilliesia, секвенировать не удалось, поскольку растительный материал планировалось получить при культивировании растений из семян, полученных из зарубежных коллекций, однако присланный семенной материал оказался нежизнеспособным. Поэтому в качестве альтернативы были секвенированы виды растений, относящихся к родам Ixiolirion, Gethyllis, Ipheion и Caliphruria (а именно: Ixiolirion tataricum (Pall.) Schult.&SCHULT.F., Gethyllis namaquensis (Schönland) Oberm., Ipheion uniflorum (Raf.) Traub., Caliphruria subedentata Baker.). Род Ixiolirion, по мнению одних авторов - монотипный, других - олиготипный, представляет собой крайне изолированную систематически группу однодольных, точное положение которой внутри порядка Asparagales до сих пор не вполне ясно. Исторически по ряду морфологических признаков этот род сближали с амариллисовыми и даже включали в это семейство, однако полное отсутствие алкалоидов, столь характерных для амариллисовых в узком смысле, вызывало сомнения в родстве этих групп ещё до распространения молекулярной филогении (Takhtajan, 1997). Традиционно было также выделение рода в отдельное семейство с неясным родством внутри однодольных. С момента возникновения системы APG обнаружилось, что по некоторым молекулярным маркерам иксиолирионы близки представителям сем. Tecophileaceae, ещё одной изолированной группе однодольных с не вполне ясным систематическим положением и с крайне дизруптивным ареалом (Чили и Южная Африка), географически очень далеким от области распространения Ixiolirion (пустыни и степи Передней, Средней и Центральной Азии). Таким образом, мы выбрали род Ixiolirion в качестве представителя аутгруппы. Дополнительными аргументами послужили предположения о том, что сиквенс полного пластома этого рода позволит уточнить положение этой сложной группы в порядке Asparagales и сравнить его с последовательностями пластомов симпатрических этой группе амариллисовых, обладающих схожими адаптациями к аридности. Давно отмечаемое морфологическое сходство Ixiolirion с амариллисовыми может оказаться внешним проявлением параллелизма в приспособлениях к условиям пустынь; возможное выявление параллелизмов между этими группами в строении пластома позволит приблизиться к пониманию того, как эти адаптации работают на генном уровне. Другие растения со «скамейки запасных» (Gethyllis, Caliphruria, Ipheion) относятся к семейству Amaryllidaceae. Род Gethyllis, распространённый преимущественно в засушливых биотопах Южной Африки - один из представителей так называемого "ядра" (core) семейства, относительно близок типовому роду Амариллис. Южную Африку нередко считают центром, откуда начались дивергенция и расселение семейства амариллисовых, поскольку именно здесь, на относительно небольшой территории, наблюдается наибольшее разнообразие семейства на уровне крупных таксонов. Виды рода Gethyllis, приспособившиеся к экстремально жестким условиям произрастания в пустынях, выработали значительное количество разнообразных морфологических адаптаций для минимизации испарения и улавливания атмосферной влаги, многие из которых независимо развились у иных групп амариллисовых в пустынях других континентов, в частности, у пустынных представителей рода Allium. Caliphruria - представитель так называемой андской клады амариллисовых, объединенной географией и общим происхождением [Meerow et al., 2000 «Phylogeny of the Amaryllidaceae: molecules and morphology»]. Мы планировали изучить пластомы представителей основных больших ветвей амариллисовых, поэтому анализ представителя этого рода подходит для решения задачи. Кроме того, это обитатель самого нижнего яруса дождевых тропических лесов, приспособленный к условиям низкого освещения, но не испытывающий недостатка во влаге, как и медвежий лук, Allium ursinum, и лук парадоксальный, Allium paradoxum, которые были нами исследованы (см. первую часть отчета). Поскольку у парадоксального и медвежьего луков были обнаружены значимые различия в количестве и последовательностях генов пластомов, часть из которых очевидно связана с адаптацией к среде обитания, а Caliphruria демонстрирует схожий с этими видами набор морфологических адаптаций, то в итоге этот род был включен нами в список исследуемых растений. Нам представилось интересным сравнить последовательность пластома растений этого рода с ближайшими американскими амариллисовыми, адаптировавшимися к жизни в сухих солнечных биотопах. Наконец, Ipheion (Ифейон) – относится к подсемейства Луковые, но не к роду Allium [Meerow et al., 2000 «Phylogeny of the Amaryllidaceae: molecules and morphology»]. Образцы растений Ipheion uniflorum (ваучер № 01-17-0119-20), Tulbaghia ludwigiana (ваучер № 10-17-0026-10), Nothoscordum bivalve (ваучер № 01-17-0026-10) были получены из коллекции ботанического сада Оснабрюкского университета Германии, Gethyllis namaquensis, Amaryllis belladonna и Caliphruria subedentata из Ботанического сада МГУ им. М.В. Ломоносова (филиал “Аптекарский огород”) в г. Москва, образцы Ixiolirion tataricum собраны в ходе поездки в Киргизию в 2018 году. Из вышеуказанных образцов было проведено выделение хлоропластной ДНК, которую использовали для дальнейшей работы. Высокопроизводительное секвенирование проводили на платформе Illumina MiSeq и платформе полупроводникового секвенирования IonTorrent S5. Для Illumina парноконцевые библиотеки (2х250 п.о.) были подготовлены с помощью набора NEBNext® DNA Library Prep Master Mix Set for Illumina (E6040, NEB, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Для IonTorrent S5 были приготовлены библиотеки с помощью набора Ion Xpress™ Plus Fragment Library Kit (4471269, Thermo Fisher, США) на чипах для секвенирования Ion 540 (A27766, Thermo Fisher, США). Собрку генома осуществляли по следующему биоинформатическому протоколу: 1) удаление адаптерных последовательностей, фильтрация и удаление коротких ридов (меньше 10 п.о.) c помощью программного обеспечения bbduk в составе пакета BBTools (https://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/); 2) Объединение парных ридов с помощью программного обеспечения bbmerge в составе пакета BBTools; 3) Сборка обработанных данных секвенирования de novo с помощью ассемблера Spades 3.12.0 (http://cab.spbu.ru/software/spades/) c установленными параметрами на аккуратную сборку с коррекцией ошибок ридов (алгоритм BayesHammer) и мисматчей при сборке (алгоритм BWA); 4) картирование полученных контигов на референсные последовательности хпДНК из базы данных GenBank и оценка качества сборки программой QUAST 5.0 (http://cab.spbu.ru/software/quast/). В результате проведённых работ были секвенированы 9 хлоропластных ДНК и собраны de novo драфты 4 хлоропластных геномов. Сборка Ipheion uniflorum состоит из 3671 контигов, из которых 11 длиной более 10000 п.о. Самый длинный контиг равен 29524 п.о., N50=1215, L50=977. Общий процент покрытия контигов на референсные хлоропластные геномы 52,3%. Сборка Tulbaghia ludwigiana состоит из 5330 контигов, из которых 9 длиной более 10000 п.о. Самый длинный контиг равен 44309 п.о., N50=1149, L50=1564. Общий процент покрытия контигов на референсные хлоропластные геномы 55,5%. Сборка Ixiolirion tataricum состоит из 101497 контигов, из которых 4 длиной более 10000 п.о. Самый длинный контиг равен 18898 п.о., N50=928, L50=39691. Общий процент покрытия контигов на референсные хлоропластные геномы 17,8%. Сборка Nothoscordum bivalve состоит из 14137 контигов, из которых 47 длиной более 10000 п.о. Самый длинный контиг равен 50989 п.о., N50=1468, L50=3604. Общий процент покрытия контигов на референсные хлоропластные геномы 58,6%. С учётом того, что хпДНК содержит длинные инвертированные повторы, которые программы по сборке геномов не способны корректно учитывать, величина покрытия драфтов будет соответствовать ~80-90% у всех, кроме Ixiolirion tataricum - ~50%. Сборку Ixiolirion tataricum необходимо доработать. Резкое отличие от других собранных драфтов по покрытию может свидетельствовать о наличии бактериального загрязнения, нарушающего правильную сборку, что требует дополнительной фильтрации данных секвенирования. Для видов Amaryllis belladonnа, Nothoscordum bivalve, Gethyllis namaquensis, Caliphruria subedentata были получены данные секвенирования в количестве, которое достаточно для сборки пластомов. В настоящее время проводятся работы по сборке пластомов. Собранные draft-последовательности пластомов представлены на интернет ресурсе нашей научной группы www.chloroplast.ru. Часть 3 В ходе полевого исследования в Киргизии на северных склонах Киргизского хребта в районе ущелья Кегеты у высокогорного озера Кёль-Тор (2725 метров над уровнем моря) и его окрестностях (Ыссык-Атинский район) был проведен сбор образцов видов A. semenovii и A. platyspathum из различных популяций. Эти образцы планируется в дальнейшем использовать для проведения популяционных генетических исследований. Также были собраны другие представители средне- и высокогорной флоры, в том числе и Ixiolirion tataricum, часть из которых в живом виде поступила в коллекцию ботанического сада, тогда как гербарные образцы переданы в гербарий МГУ им. М.В. Ломоносова. | ||
2 | 1 января 2019 г.-15 декабря 2019 г. | Эволюция пластомов у растений подсем. Allioideae, адаптировавшихся к обитанию в различных экологических нишах |
Результаты этапа: | ||
3 | 1 января 2020 г.-26 декабря 2020 г. | Эволюция пластомов у растений подсем. Allioideae, адаптировавшихся к обитанию в различных экологических нишах |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".