ИСТИНА

Проводится экспериментальная работа по химико-ферментативному синтезу генов светочувствительных протонных насосов - ксенородопсинов PoXeR и NsXeR с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции) с использованием химически синтезированных олигонуклеотидных праймеров. Проводится клонирование полученных генов ксенородопсинов PoXeR и NsXeR в промежуточные плазмидные векторы по соответствующим сайтам рестрикции, устанавливается нуклеотидная последовательность генов ксенородопсинов методом ДНК-секвенирования, производится выбор клонов с правильной нуклеотидной последовательностью генов PoXeR и NsXeR для дальнейшей работы. Проводится работа по созданию новых экспрессионных векторов для экспрессии ксенородопсинов PoXeR и NsXeR в нервных клетках. В составе новых экспрессионных векторов гены ксенородопсинов PoXeR и NsXeR соединены на 3'-конце через линкерную последовательность с генами репортерных флуоресцентных белков. Создание новых экспрессионных векторов проводится на основе методов биоинженерного конструирования, включающих дизайн и химический синтез олигонуклеотидных праймеров, а также сборку рекомбинантных генов и линкерных последовательностей методом ПЦР. Разрабатываются методы трансфекции экспрессионными векторами культур клеток НЕК293 и нервных клеток, а также методы их последующего электрофизиологического и морфологического анализа. Проводится изучение эффективности трансфекции ксенородопсинами PoXeR и NsXeR клеток с помощью флуоресцентных методов детекции, в том числе, ЛСКМ (лазерной сканирующей конфокальной микроскопии), а также фотоиндуцированных токов с помощью электрофизиологических методов.

Experimental work is being carried out on the chemical-enzymatic synthesis of photosensitive proton pump genes, xenorodopsin PoXeR and NsXeR, using PCR (polymerase chain reaction) using chemically synthesized oligonucleotide primers. The obtained PoXeR and NsXeR xenorodopsin genes are cloned into intermediate plasmid vectors at the corresponding restriction sites, the nucleotide sequence of xenorodopsins genes is determined by DNA sequencing, and clones with the correct PoXeR and NsXeR genes are selected for further work. Work is underway to create new expression vectors for the expression of PoXeR and NsXeR xenorodopsins in nerve cells. As part of the new expression vectors, the xenorodopsin PoXeR and NsXeR genes are connected at the 3'-end through a linker sequence to the genes of reporter fluorescent proteins. Creation of new expression vectors is carried out on the basis of bioengineering design methods, including the design and chemical synthesis of oligonucleotide primers, as well as the assembly of recombinant genes and linker sequences by PCR. Methods for transfection with expression vectors of cell cultures of HEK293 cells and nerve cells, as well as methods for their subsequent electrophysiological and morphological analysis, are being developed. The efficacy of transfection of xenorodopsin PoXeR and NsXeR cells using fluorescence detection methods, including LSCM (laser scanning confocal microscopy), as well as photo-induced currents using electrophysiological methods is being studied.

В ходе выполнения НИР должны быть получены гены новых ксенородопсинов (протонных насосов) PoXeR и NsXeR. Рекомбинантные гены должны быть встроены по соответствующим сайтам рестрикции в экспрессионный вектор, позволяющий производить трансфекцию эукариотических клеток. Должна быть определена нуклеотидная последовательность генов ксенородопсинов PoXeR и NsXeR в составе плазмидных векторов методом ДНК-секвенирования по двум цепям. Должны быть отработаны методы трансфекции экспрессионными векторами культур клеток НЕК293. Должны быть отработаны методы флуоресцентной детекции уровня экспрессии ксенородопсинов в клетках НЕК293 и произведена оценка уровня флуоресцентного сигнала на мембранах клеток, экспрессирующих ксенородопсины PoXeR или NsXeR. Должны быть отработаны методы трансфекции экспрессионными векторами первичных диссоциированных нейрональных культур, а также методы их последующего электрофизиологического и морфологического анализа.

Научно-исследовательские работы на тему: "Получение и исследование рекомбинантных светочувствительных белков-канальных родопсинов, регулирующих электрофизиологическую активность нейронов,для их последующего использования с целью восстановления зрительных функций дегенеративно поврежденной сетчатки при помощи оптогенетических технологий"; "Получение рекомбинантных канальных родопсинов для локализованной экспрессии в нейронах и изучение возбуждающего и тормозного рецептивных полей трансфецированных клеток с целью восстановления зрительных функций дегенеративно поврежденной сетчатки при помощи оптогенетических технологий"; "Восстановление зрительных функций дегенеративно поврежденной сетчатки при помощи оптогенетических технологий"

В результате выполнения проекта получены и охарактеризованы экспериментальные образцы экспрессионных плазмидных векторов, кодирующих светочувствительные белки - протонный насос ксенородопсин PoXeR, слитый с геном флуоресцентного белка Venus; протонный насос ксенородопсин NsXeR, слитый с геном флуоресцентного белка Venus. Экспериментальные образцы плазмидных векторов, экспрессирующие протонные насосы - ксенородопсины, наработаны в количестве, необходимом для трансфекции культур эукариотических клеток. Определена нуклеотидная последовательность генов PoXeR и NsXeR в составе плазмидных векторов по двум цепям ДНК. Показано, что в ответ на световую стимуляцию ксенородопсины обеспечивают надпороговую дерполяризацию нервной клетки и осуществляют генерацию нервных импульсов.