ИСТИНА

Проект посвящен синтезу и изучению биологических свойств in vitro новых смешаннолигандных комплексов меди, содержащих гетарилбензотиазольный, тиогидантоиновый, фенантролиновый и терпиридиновый фрагменты - потенциальные притивоопухолевые агенты. Основной задачей проекта является разработка методов синтеза новых смешанных лигандов, содержащих два координирующих фрагмента и исследование их в реакциях комплексообразования с солями меди.

he project is devoted to the synthesis and study of the biological properties of new mixed ligand copper complexes containing hetaryl benzothiazole, thiogidantoin, phenanthroline and terpyridine fragments, potential antitumour agents. At the moment, the basis of modern oncotherapy is platinum coordination compounds, cisplatin derivatives. To date, several generations of platinum preparations have been developed and introduced into clinical practice, but to overcome their main drawback - a high total toxicity leading to the development of severe side effects was not possible. That is why the attention of researchers is now focused on the search for and introduction of antitumor drugs based on biogenic metals into clinical practice. Recently, a great interest of researchers is connected with the search for new types of Cu-containing therapeutic agents. A new class of mixed ligand coordination compounds Cu (II) CASEOPEINAS, which are currently undergoing preclinical trials, was developed. Thus, the main objective of this project is to develop methods for the synthesis of new mixed ligands containing two coordinating fragments, their investigation in complexation reactions with copper salts and biological testing. The key stage of the synthetic work is the production of ligands, which combine in one molecule two coordinating fragments (hetaryl benzothiazole, thiogidantoin, phenanthroline, terpyridine). Further, all ligands will be investigated in complexation reactions with Cu (II) salts, the composition and structure of the resulting metal complexes are studied. Information on the obtaining of ligands of these structural types and their coordination compounds is absent. The final stage of the project is to evaluate the cytotoxicity of ligands and coordination compounds. For the most effective compounds, testing will be carried out on cultures of human tumor cells cultured in vitro.

Конечной целью проекта является разработка препаративных методик получения новых N,S-содержащих органических лигандов и их координационных соединений с Cu(II) и Cu(I), оценка цитотоксичности всех полученных соединений и определение их биоактивности после тестирования на культурах опухолевых клеток человека, культивируемых in vitro. А именно: 1. Будет проведен синтез, оптимизация и масштабирование методов получения неизвестных ранее смешанных лигандов на основе гетарилбензотиазолов (структурный тип 1-3). Изучены физико-химические характеристики полученных соединений методами ЯМР и ИК спектроскопии, масс-спектрометрии, элементного анализа. Исследована возможность получения медьсодержащих комплексов данных лигандов. В случае получения комплексов различных структурных типов - проведен анализ влияния заместителей в лиганде на структуру образующегося координационного соединения. Будет проведено электрохимическое исследование лигандов и комплексов этого структурного типа и изучение их антиоксидантной и каталитической активностей. По данной части проекта будут подготовлены две публикации в высокорейтинговые журналы; планируется участие членов научного коллектива с докладами в трех научных конференциях. 2. Разработка методов синтеза новых, ранее не описанных смешанных лигандов на основе 2-тиогидантоинов с фенантролинами и терпиридинами (структурный тип 4-5). Изучены физико-химические характеристики полученных соединений методами ЯМР и ИК спектроскопии, масс-спектрометрии, элементного анализа. Исследование их в реакциях комплексообразования с солями Cu(II) и Cu(I), характеризация полученных координационных соединений в кристаллическом состоянии и в растворе, их изучение электрохимическими методами. Результаты выполнения данной части проекта будут изложены в виде одной статьи и представлены на двух научных конференциях. 3. Для всех полученных соединений будет проведена оценка цитотоксичности, наиболее эффективные соединения будут протестированы на культурах опухолевых клеток человека, культивируемых in vitro. Результаты будут представлены в виде тезисов доклада на одной научной конференции.

A convenient synthesis of copper(II) bis[5-(pyridin-2-yl-methylidene)-2-thiohydantoin]copmlexes / I. Salimova, A. Udina, A. Mironov, A. Majouga, N. Zyk, E. Beloglazkina / Mend. Comm., 28, 2018, 524-526. New copper thiohydantoin complexes: Synthesis, characterization, and assessment of their interaction with bovine serum albumin and DNA / K. Tishchenko, E. Beloglazkina, M. Proskurnin, V. Malinnikov, D. Guk, M. Muratova, O. Krasnovskaya, A. Udina, D. Skvortsov, R. Shafikov, Y. Ivanenkov, V. Aladinskiy, I. Sorokin, O. Gromov, A. Majouga, N. Zyk / J. of Inorg. Biochem., 175, 2017, 190-197. An Improved Protocol for Synthesis of 3-Substituted 5-Arylidene-2-thiohydantoins: Two-step Procedure Alternative to Classical Methods / Kuznetsova O.Yu., Antipin R.L., Udina A.V., Krasnovskaya O.O., Beloglazkina E.K., Terenin V.I., Koteliansky V.E., Zyk N.V., Majouga A.G. /J. of Het. Chem., 53, № 5, 2016, 1570-1577. Mixed Valence Copper(I,II) Binuclear Complexes with Unexpected Structure: Synthesis, Biological Properties and Anticancer Activity / Majouga A.G., Zvereva M.I., Rubtsova M.P., Skvortsov D.A., Mironov A.V., Azhibek D.M., Krasnovskaya O.O., Gerasimov V.M., Udina A.V., Vorozhtsov N.I., Beloglazkina E.K., Leonid A., Mikhina L.V., Tretyakova A.V., Zyk N.V., Zefirov N.S., Kabanov A.V., Dontsova O.A. / J. of Med. Chem., 57, 2014, 6252-6258. Synthesis, X-ray crystallography and electrochemistry of three novel copper complexes with imidazole-containing hydantoin and thiohydantoins / Beloglazkina E.K., Majouga A.G., Mironov A.V., Yudina A.V., Moiseeva A.A., Lebedeva M.A., Khlobystov A.N., Zyk N.V. / Polyhedron, 63, 2013, 15-20. The first tris(imidazolylbenzothiazole)copper(II) complex / Beloglazkina E.K., Barskaya E.S., Majouga A.G., and N.V. Zyk / Mend. Comm., 25, 2015, 148-149.

Были получены комплексные соединения меди на основе 2-гетарилбензотиазолов с заместителями различной природы. Была показана принципиальная возможность получения металлсодержащих координационных соединений с лигандами данного типа (схема 1). Получение указанных соединений позволило отработать и масштабировать синтетические стратегии получения координационных соединений. В результате были получены моно- и бис-лигандные комплексы меди(II) с 2-(2-пиридил)бензатиазолами. Полученные соединения были охарактеризованы методом рентгеноструктурного, элементного анализа, ИК- и УФ-спектроскопии, а также данными электрохимических исследований методами ЦВА и ВДЭ. Лиганды 1a-с и комплексы меди 2а-с и 3а-с были протестированы на цитотоксическую активность in vitro в отношении клеток MCF-7 и A-549, а также в отношении линий доброкачественных клеток Hek-293 и Va-13 (Таблица 1). Измерения проводились стандартным методом МТТ. Результаты показали умеренную цитотоксичность всех комплексов меди против раковых клеток; лиганды значительно менее цитотоксичны. Важно отметить, что была показана селективная цитотоксичность соединений 2a-с и 3a-с по отношению к раковым клеткам молочной железы in vitro. На основе ранее полученного гидроксибензотиазола (1a) был получен новый класс дитопных органических лигандов типа гетарилбензотиазол-тиогидантоин. Соединение координирующих фрагментов молекул осуществлялось двумя разными способами. В первом случае проводили реакцию S-алкилирования замещенного тиогидантоина 2-алкилгалогензамещенным гетарилбензотиазолом с различной длиной полиметиленового линкера между галогеном и бензотиазольным фрагментом. Предварительно была получена серия ꞷ-галогеналкилзамещенных гетарилбензотиазолов. Лиганды были получены реакцией алкилирования 2-(пиридин-2-ил)-бензотиазол-6-ола 1a α,ω-дибромалканами или α-бром-ω-хлоралканами. Оптимизацию условий реакции проводили на примере алкилирования соединения 1a 1,4-дибромбутаном в присутствии основания, при этом было опробовано два основания: карбонат калия и карбонат цезия. Первоначально реакцию проводили в ДМФА (Схема 2). Однако, согласно данным масс-спектрометрии высокого разрешения (МСВР), в результате реакции образовывался продукт гидролиза целевого продукта, независимо от используемого основания. Гидролиз, по всей видимости, протекает из-за примеси воды в растворителе, удаление которой, в случае ДМФА, является достаточно трудоемкой задачей. Поэтому в дальнейшем реакции проводили в абсолютированном ацетонитриле (Схема 3). Независимо от основания, в результате реакции образуются два продукта: целевой продукт, в котором один атом брома замещен на бензотиазольный фрагмент, и побочный продукт, в котором замещены оба атома брома. Однако соотношение продуктов реакции при использовании разных оснований отличается. Так, при использовании карбоната калия как основания выходы продуктов монозамещения и дизамещения относятся как 3 к 1, а в случае карбоната цезия – 1.5 к 1. Для подтверждения наблюдаемой зависимости была проведена аналогичная реакция с 1,6-дибромгексаном (Схема 4). Как и в случае с 1,4-дибромбутаном, при использовании карбоната калия доля целевого продукта больше: выходы относятся как 4.2 к 1 для K2CO3 и 2.5 к 1 для Cs2CO3. Данная зависимость согласуется тем фактом, что карбонат калия является более мягким основанием, что проявляется в меньшей равновесной концентрации фенолят-анионов, выступающих в роли нуклеофила в данной реакции. Поэтому в дальнейшем в качестве основания был использован карбонат калия. С помощью оптимизированной методики была получена серия соединений с различной длиной углеводородного линкера между координирующими фрагментами. Состав и строение целевых соединений были доказаны по совокупности результатов 1Н, 13С ЯМР спектроскопии и МСВР. Продукты дизамещения были охарактеризованы методами 1Н ЯМР спектроскопии и МСВР, 13С ЯМР спектры для них загеристрировать не удалось ввиду крайне низкой растворимости выделенных соединений. Во избежание образования продукта дизамещения при алкилировании соединения 1a нами были проведены реакции с 1-бром-3-хлорпропаном и 1-бром-4-хлорбутаном. В результате были получены соединения 4а и 5а без примеси побочного симметричного продукта (Схема 5). Полученными галогенметиленбензотиазолами было проведено алкилирование (Z)-4-фенил-2-(пиридин-2-илметилен)-5-тиоксопирролидин-3-она. Таким образом, были получены соединения, представленные на схеме 6. В качестве побочных продуктов, были получены, выделены и охарактеризованы бис-гетарибензатиазольные лиганды с различной длиной линкера (6-10b). Такие соединения являются гомотопными, но также имеют два хелатирующих центра, что открывает возможности для синтеза гетероядерных координационных соединений на их основе. Полученный лиганд 11b был введен в реакции комплексообразования с дигидратом хлорида меди(II) в соотношении лиганд:соль 1:1, а лиганд 7b был введен в реакцию с гексагидратом перхлората меди(II) в соотношении 1:1. Получить кристаллы данных комплексов, пригодные для РСА, на данный момент не удалось, однако состав комплексов подтвержден данными элементного анализа. Другим способом конъюгирования исходных соединений является реакция азид-алкинового циклоприсоединения, на основе полученного N-замещенного 2-тиогидантоина и 2-гетарилбензотиазола с заместителем с терминальной тройной связью. По такой реакции был получен ряд смешанных лигандов, связанных между собой через триазольное кольцо (Схема 7). Полученные лиганды исследованы в реакциях комплексообразования с хлоридом меди(II) в соотношении 1:1 и 1:2. Показано, что в результате реакции в соотношении 1:1 образуются координационные соединения состава LCuCl2 с координацией меди только по одному пиридилбензотиазольному фрагменту (16a,b), в случае проведения реакции 1:2 образуется продукт состава LCu2Cl4с координацией меди как по пиридилбензотиазольному фрагменту, так и по тиогидантоиновому фрагменту (17). Также нами была разработана синтетическая стратегия получения дитопных органических лигандов, содержащих в качестве координирующих фрагментов разной природы фрагменты терпиридина и бензотиазола (Схема 8). Были получены соединения с различной длиной полиметиленового линкера. Лиганды были получены двумя способами. Первый способ заключался в алкилировании гидроксибензотриазола 1a соответствующими 4’-фенилзамещенными терпиридинами 19. Второй – в алкилировании 4’-гидроксифенилтерпиридина о-замещенными бензотиазолами. Оба метода позволяют получать целевые соединения 20 с хорошими выходами. На основе лигандов 20 были получены соответствующие комплексы 21 и 22 обработкой эквимолярными количествами CuCl2*2H2O или Cu(ClO4)2*6H2O, соответственно (Схема 9). Все выделенные координационные соединения представляют собой моноядерные комплексы со стехиометрией 1:2 (металл/лиганд); ни полиядерные комплексы, ни комплексы с соотношением металл/лиганд 1:1 не были получены. Структура полученных координационных соединений была доказано методом РСА. В координации металлов участвуют только фрагменты терпиридинового лиганда; пиридилбензотиазольные фрагменты остаются некоординированными. Комплексы 21b и 22b представляют собой моноядерные комплексы Cu(II), но с различным соотношением металл :лиганд. В комплексе 21b атом меди координирован одним лигандом терпиридина и двумя хлорид-анионами с искаженной тетрагональной пирамидальной геометрией (Рис. 1). Напротив, медь в 22b координирована двумя терпиридиновыми лигандами и имеет октаэдрическую геометрию кооринационного окружения (Рис. 2). Полученные комплексы меди с лигандами данного структурного типа также были протестированы на их цитотоксическую активность in vitro в отношении клеток MCF-7 и A-549, а также в отношении линий доброкачественных клеток Hek-293 и Va-13 (Таблица 2). Измерения проводились стандартным методом МТТ. Результаты показали умеренную цитотоксичность всех комплексов меди против линии раковых клеток, сравнимую с цисплатином; лиганды значительно менее цитотоксичны. Анализирую полученные результаты по цитотоксичности координационных соединений, можно отметить, что комплекс 12 с перхлоратом меди нетоксичен, комплексы 16а и 17 с триазольным линкером токсичнее, чем комплекс 13 с полиметиленовым линкером. Координационное соединение 21с, образованное лигандом типа "бензотиазол-терпиридин" более токсично, чем комплексы с лигандами ряда "бензотиазол-тиогидантоин". При добавлении избыточного количества соли меди(II) к лигандам 20 мы ожидали получить би- и триметаллические координационные соединения, однако выделить комплексы такого строения нам не удалось. Для исследования возможности получения гетеробиметаллических комплексов на основе лиганда 20 с другими металлами мы добавили к медьсодержащему соединению 22b комплекс родия(III) 24 (Схема 10). Чтобы показать возможность взаимодействия координационных соединений 24 и 22b с образованием гетеробиметаллического комплекса, мы исследовали взаимодействие этих соединений в растворе ДМСО методом ЦВА. Полученные данные подтверждают изменение координации иона родия в ходе реакции между 22b и 24, а также сохранение координации иона меди терпиридиновым лигандом. Возможные структуры образующегося биметаллического координационного соединения 25 показаны на Схеме 11. К сожалению, попытки выделить получающийся комплекс после совместного кипячения соединений 22b и 24 в ДМСО с последующим охлаждением реакционной смеси привели к образованию порошкообразного вещества, которое имеет чрезвычайно низкую растворимость во всех протестированных органических растворителях. На сегодняшний день нам не удалось получить кристалл соединения 25, пригодный для рентгеноструктурных исследований. По данным элементного анализа образовавшийся осадок не является ни чистым комплексом 25a, ни 25b, а, по-видимому, представляет собой сложную для разделения смесь этих соединений. Другой метод соединения терпиридинового и бензотиазольного фрагментов представляет собой реакцию азид-алкинового циклоприсоединения в присутствии солей меди (I) (Схема 12). В результате были получены дитопные лиганды 26 с различной длиной метиленового линкера. На основе лигандов 26 были синтезированы координационные соединения 27. Комплексы были получены взаимодействием эквимолярных количеств CuCl2*2H2O. Как и ожидалось, были получены координационные соединения такого же строения, как и комплексы 22. На следующем этапе мы планировали осуществить синтез дитопных лигандов на основе тиогидантоина и терпиридина. Изначально в качестве соединяющего линкера между двумя координирующими фрагментами – терпиридиновым и тиогидантоиновым –был протестирован полиметиленовый. Для этого нами были получены S-алкилированные тиогидантоины с различными заместителями в третьем положении тиогидантоинового цикла (Схема 13). Соединения 31 были получены путем алкилирования 2-тиогидантоинов α,ω-дибромалканами в ДМФА в присутствии К2СО3. Соединения 32 - алкилированием 2-тиогидантоинов α-бром-ω-хлоралканами в ацетонитриле в присутствии Сs2СО3. В результате было показано, что получение S-алкиированных 2-тиогидантоинов в присутствии карбоната цезия является более эффективным методом синтеза таких соединений. На следующей стадии мы вводили соединения 32а и 31d в реакцию с 4’-гидрокситерпиридином 18 в присутствии различных оснований и растворителей - Cs2CO3 в ацетонитриле, К2СО3 в ДМФА, однако смешанных дитопных лигандов типа «терпиридин-тиогидантоин» получить не удалось. Вторым испробованным способом получения лигандов такого типа была реакция азид-алкинового циклоприсоединения. На первом этапе нами были получены соответствующие азиды и алкины (Схема 14). В Таблице 3 приведены использованные условия реакции азид-алкинового циклоприсоединения, однако, целевой дитопный лиганд типа «тиогидантоин-терпиридин» ни одним из предложенных способов получить также не удалось. Поскольку получение лигандов такого типа оказалось затруднительным, нами была предложена еще одна синтетическая стратегия по соединению терпиридин- и тиогидантоин-содержащих фрагментов. Была проведена реакция получения соответствующих сложных эфира из кислоты 49 и спиртов 45 (Схема 15). В результате был успешно синтезирован лиганд 50, который далее вводили в реакцию комплексообразования с хлоридом меди(II). Таким образом, нами были разработаны синтетические стратегии получения дитопных органических лигандов на основе трех координирующих фрагментов разной природы – 2-пиридилбензотиазол, терпиридин, 5-(2-пиридил)тиогидантоин. Были изучены реакции комплексообразования полученных лигандов с солями меди(II). Показано, что наиболее высокой цитотоксической активностью в ряду синтезированных соединений обладают комплексы с хлоридом меди(II) с лигандами типа «бензотиазол-терпиридин»; комплексы с перхлоратом меди(II) с лигандами типа «бензотиазол-бензотиазол» оказались нетоксичны. Кроме того, была показана возможность получения гетерометаллических полиядерных координационных соединений на основе лигандов 20.