ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Метаболические болезни, ассоциированные с ожирением, являются одной из ведущих причин смертности и инвалидизации трудоспособного населения во всем мире. Стандартные методы лечения ожирения обладают либо низкой эффективностью, либо имеют серьезные побочные эффекты. Наиболее перспективным на сегодняшний день способом терапии ожирения является индукция появления бурых адипоцитов в белой жировой ткани, что приводит к существенному снижению ее объема. В данной работе мы выясним механизм норадреналин-индуцируемого побурения жировой ткани. Мы предполагаем, что найденный нами ранее механизм переключения внутриклеточной передачи сигнала с цАМФ-зависимого сигнального пути на кальций-зависимый путь ассоциирован с дифференцировкой МСК в бурые адипоциты. Эту гипотезу мы проверим при помощи методов анализа функциональной активности на уровне одиночных клеток. Во-первых, при помощи ингибиторного анализа мы установим, какие рецепторы и активируемые ими сигнальные каскады ассоциированы с дифференцировкой МСК в бурые адипоциты. Во-вторых, используя разработанный нами метод регистрации адипогенной дифференцировки на уровне одиночных клеток мы проследим дифференцировочную судьбу клеток, отвечающих на норадреналин кальциевой сигнализацией. В-третьих, используя клеточный сортинг клеток, содержащих функционально-активные альфа1А-адренорецепторы, мы независимым методом проверим результаты наблюдений за дифференцировкой одиночных клеток. Понимание молекулярных механизмов индукции появления бурых адипоцитов в белой жировой ткани позволит существенно улучшить подходы к лечению ассоциированных с ожирением болезней, используемые в регенеративной медицине.
Metabolic diseases associated with obesity are among the main causes of mortality and disability of employable population throughout the world. Standard methods of obesity treatment are of low efficacy or have serious side-effects. The most promising and safe method of obesity therapy is induction of differentiation of adipose derived mesenchymal stem/stromal cells (MSC) into the brown adipocytes, what significantly reduces the volume of adipose tissue. In this work we will investigate the mechanisms of noradrenaline-induced browning of white adipose tissue. Early we showed the mechanism for switching intracellular signaling from cAMP-dependent to calcium-dependent pathways in MSC during noradrenaline stimulation. We suppose that this mechanism may be associated with changes in the differentiation properties of MSC and their differentiation into brown adipocytes. This hypothesis will be tested using methods of single cell analysis of functional activity. First, using an inhibitory analysis we will reveal which receptors and signaling cascades are associated with MSC differentiation into brown adipocytes. Secondly, we will track differentiation fate of individual cells which are responding to noradrenaline with calcium signaling. We will use the method of detecting of differentiation process at the single cell level in real time, which we have recently developed. Thirdly , using cell sorting technology, we will isolate the cells which express not just adrenergic receptor proteins, but functionally active receptors. These cells will be directed into adipogenic differentiation to confirm the results of other using approaches. Understanding of molecular mechanisms of white adipose tissue browning will allow to improve approaches in regenerative medicine for treatment obesity associated metabolic diseases.
Задача 1. Мы предполагаем, что эффект альфа1- и бета-адренорецепторов на адипогенную дифференцировку МСК носит нелинейный характер. Переключение дифференцировочной программы МСК на превращение в бурые адипоциты не должно происходить при любом появлении катехоламинов в крови. Только продолжительное и повторяющееся воздействие сначала приводит к обратимой гетерологической сенситизации клеток, а потом, если норадреналин действует повторно, к коммитированию клетокв сторону дифференцировки в бурый жир. Задачи 2 и 3. Мы предполагаем, что только клетки, входящие в субпопуляцию МСК, экспрессирующих функционально активные альфа1А-адренорецепторы и способные отвечать на действие норадреналина кальциевой сигнализацией, дифференцируются в бурые адипоциты. Мы проверим это предположение методами анализа сигнализации и дифференцировки на уровне одиночных клеток. Ингибиторный анализ покажет молекулярные механизмы регуляции выбора направления дифференцировки МСК.
Ранее, анализируя чувствительность МСК к различным гормонам и нейромедиаторам, циркулирующим в крови и межтканевой жидкости, мы обнаружили, что суммарно популяция МСК чувствительна ко всем проанализированным агонистам, однако отдельные клетки оказываются чувствительными только к определенному лиганду (Kotova et al., BBA, 2014). Таким образом, клетки популяции МСК, являясь в высокой степени гомогенными по морфологии и фенотипу, проявляют большое разнообразие функциональной активности. Изучая гормональную регуляцию функциональной активности МСК, мы обнаружили оригинальный механизм регуляции чувствительности этих постнатальных стволовых клеток к норадреналину. Этот механизм заключается в обратимой гетерологической сенситизации (этот термин означает повышение чувствительности одних рецепторов при стимуляции других) альфа-1А-адренергических рецепторов при активации бета-адренорецепторов (Tyurin-Kuzmin, Fadeeva et al. 2016). Мы предполагаем, что образующиеся МСК, отвечающие на норадреналин кальцием, могут быть клетками, способными дифференцироваться в бурые адипоциты. Но этот потенциал может реализовываться только при последовательной активации сначала бета-адренорецепторов (для потенциации альфа1а-адренорецепторов), потом самих альфа1А-адренорецепторов для запуска выхода кальция в цитоплазму. Более того, из литературных данных известен феномен дополнения взаимных эффектов бета-агонистов и альфа1-агонистов на дифференцировку МСК в бурые адипоциты in vitro (Rehnmark, Nechad et al. 1990). Однако механизм этого феномена так и остался невыясненным, также как и его возможное практическое применение. Таким образом, мы предполагаем, что обнаруженный нами механизм обратимого переключения внутриклеточной сигнализации МСК в ответ на норадреналин может быть связан с выбором направления дифференцировки МСК между превращением в белые и бурые адипоциты.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 8 декабря 2018 г.-31 декабря 2019 г. | Индукция дифференцировки постнатальных стволовых клеток в бурые адипоциты как новый подход в терапии метаболических болезней, ассоциированных с ожирением |
Результаты этапа: Для выполнения первой задачи гранта – выяснения того, каким образом альфа1- и бета-адренорецепторы регулируют дифференцировку МСК в белый и бурый жир – на первом этапе было проведено исследование динамики появления и изменения концентрации мРНК ключевых маркеров адипогенной дифференцировки МСК. Клетки направляли в адипогенную дифференцировку при помощи редуцированного дифференцировочного коктейля для адипогенной дифференцировки МСК – смеси инсулина (10 нг/мл), ингибитора фосфодиэстеразы изобутиметилксантина (IBMX, 0,5 мМ) и глюкокортикоида дексаметазона (1 мкМ). Стандартный коктейль адипогенной дифференцировки обычно также включает в себя индометацин (100 мкМ). Это прямой активатор мастер-гена адипогенной дифференцировки PPARg. Мы его намеренно не добавляли в дифференцировочный коктейль, поскольку по нашим данным, индометацин, активируя напрямую PPARg, в обход инсулин-зависимых сигнальных путей, нивелирует тонкую настройку процесса адипогенной дифференцировки, обусловленную гормональной регуляцией МСК. МСК, направленные в адипогенную дифференцировку при помощи редуцированного дифференцировочного коктейля, дифференцируются на уровне, сравнимом со стандартным коктейлем. Как видно на Рис 1, в процессе адипогенной дифференцировки МСК накапливают жировые капли, эффективность дифференцировки достаточно высокая – порядка 90% клток подвергаетсяадипогенной дифференцировке. Еще один важный момент – накапливающиеся жировые капли возможно наблюдать под микроскопом без специальной окраски клеток, что будет крайне полезно при выполнении второй задачи гранта – наблюдении за адипогенной дифференцировкой в режиме реального времени. Для контроля того, что наблюдаемые в цитоплазме дифференцирующихся клеток капли – это действительно триглицериды, нейтральные липиды, мы воспользовались красителем, специфичным к нейтральным липидам – OilRed O. Жировые капли при этом окрашиваются в красный цвет (Рис 2). Для выполнения первой задачи гранта мы оценили, как предварительная обработка клеток норадреналином влияет на адипогенную дифференцировку. Обработку норадреналином мы производили в двух вариантах: однократная обработка клеток гормоном и с предварительной инициацией гетерологической сенситизации клеток. Во втором случае клетки за 6 часов до постановки на адипогенную дифференцировку предобрабатывали норадреналином в течение 1 часа с последующей тщательной отмывкой от гормона. Непосредственно перед запууском адипогенной дифференцировки в обоих случаях клетки обрабатывали ноардреналином в течение 1 часа (см схему на Рис 2). Далее клетки отмывали и помещали в коктейль для адипогенной дифференцировки. Коктейль меняли на свежий каждые три-четыре дня (два раза в неделю). Таким образом, норадреналин действовал на клетки только в течение короткого времени перед запуском дифференцировки. Как видно из третьей и четвертой фотографии клеток, сделанных на 14 день адипогенной дифференцировки, однократная и двукратная предобработка МСК норадреналином приводит к снижению числа клеток, накапливающих жировые капли. Для числовой оценки эффекта норадреналина на адипогенную дифференцировку МСК, а также для выяснения наиболее оптимальной временной точки регистрации уровня дифференцировки мы воспользовались методом ПЦР в реальном времени. Для этого мы останавливали на 1, 3 или 7 день адипогенную дифференцировку и в лизатах клеток измеряли относительный уровень мРНК маркеров адипогенной дифференцировки в белый жир. Ключевые маркеры дифференцированных адипоцитов – это мастер-ген адипогенной дифференцировки транскрипционный фактор PPARg адипокин, специфичный для дифференцированных жировых клеток – адипонектин. Как показано на Рис 3, уровень мРНК PPARg при адипогенной дифференцировке МСК повышается, но не более чем в 10 раз по сравнению с недифференцированными клетками. Это может быть связано с тем, что МСК находятся в преддифференцированном (коммитированном) состоянии с предварительно повышенным уровнем этого мастер-гена, что согласуется с литературными данными (Robey, 2017). При этом как однократная, так и двукратная предварительная стимуляция клеток норадреналином приводит к подавлению роста уровня мРНК PPARg. В случае мРНК адипонектина изменения оказываются гораздо значительнее. Недифференцирвоанные МСК вообще не содержат мРНК адипонектина, на третий день он появляется на детектируемом уровне, а уже на 7 день уровень его экспрессии более чем в сто раз превышает значения третьего дня (Рис 4). Подавление адипогенной дифференцировки, вызываемое норадреналином, наиболее хорошо видно на 7 день диференцировки. При этом, так же как и уровень мРНК PPARg, уровень адипонектина при двукратной стимуляции клеток норадреналином с интервалом в 6 часов, лишь усиливал эффект подавления. Вызванный однократной стимуляцией, но не производил существенно отличных от подавления эффектов. В дальнейшем для проведения ингибиторного анализа и влияния различных изоформ адренорецепторов мы лизировали клетки именно на 7 день. Для выяснения того, как активация альфа1- и бета-адренорецепторов при поочередной стимуляции в различных комбинациях повлияют на адипогенную дифференцировку МСК, мы выполнили эксперимент, схема которого показана на Рис 5. Клетки стимулировали агонистом альфа1-адренорецепторов фенилэфрином (10-4М), либо агонистом бета-адренорецепторов добутамином (10-6М). В случае ингибиторного анализа клетки обрабатывали норадреналином в присутствии селективного ингибитора ключевого сигнального фермента, активируемого бета-адренорецепторами аденилат-циклазы SQ22536 (10-6М), либо норадреналином в присутствии 2-APB, ингибитора рецептора инозитол-(1,4,5)трис-фосфата (IP3R), ключевого действующего лица передачи сигнала от рецепторов, сопряженных с Gq-белком и кальциевой сигнализацией (в случае совместной с норадреналином стимуляции ингибируется сигнализация от альфа1-адренорецепторов). Для того чтобы ингибиторы достоверно подействовали их добавляли за 30 минут до стимуляции клеток норадреналином. Первая стимуляция гормонами и агонистами длилась 1 час, после чего клетки тщательно отмывали трехкратной заменой среды и помещали в полную среду роста. Через 5 часов клетки повторно стимулировали агонистами или норадреналином в присутствии ингибиторов также в течение 1 часа. Комбинации первой и второй стимуляций указаны на рисунках через стрелку под соответствующим столбиком диаграммы. Как видно на Рис 5,Б, Норадреналин подавляет адипогенную дифференцировку МСК действуя через бета-адренорецепторы. Стимуляция бета-адренорецепторов в любых комбинациях с альфа1-адренорецепторами подавляет дифференцировку, но сами альфа1-адренорецепторы на дифференцировку не влияют. Двукратная стимуляция бета-адренорецепторов подавляет дифференцировку сильнее, чем однократная. Как показано на Рис 6, Б, норадреналин оказывал схожие эффекты на дифференцировку МСК, характеризуемую уровнем экспрессии PPARg. Ингибиторный анализ норадреналин-зависимой регуляции адипогенной дифференцировки МСК показал менее однозначные результаты. С одной стороны, блокирование сигнальных каскадов, активируемых бета-адренорецепторами при помощи SQ22536 привело к нивелированию эффекта норадреналина на подавление дифференцировки. Это полностью согласуется с результатами, показанными при помощи специфических агонистов адренорецепторов. В то же время, подавляющий эффект норадреналина нивелировался при ингибировании кальций-зависимых сигнальных каскадов при помощи 2-APB. Более того, уровень экспрессии мРНК адипонектина показывал даже тенденцию к некоторому росту. Можно предположить, что кальциевая сигнализация необходима для подавления норадреналином дифференцировки МСК, но тогда возникает вопрос, почему стимуляция входа кальция фенилэфрином не влияла на дифференцировку. Возможное объяснение может быть следующее. Для подавляющего действия цАМФ-зависимых сигнальных путей, активируемых через бета-адренорецепторы, требуется синергичное действие кальциевых сигнальных путей, активируемых на базальном уровне. При их блокировании цАМФ перестает действовать. Объяснение данного феномена требует дальнейших экспериментов . Для выяснения участия гетерологической сенситизации в регуляции дифференцирвоки МСК в бурые адипоциты мы измеряли уровень экспрессии мРНК разобщающего белка митохондрий, UCP1. Сбрасывая трансмембранный электрохимический потенциал протонов на внутренней мембране митохондрий в результате чего выделяется тепло, этот белок является специфическим маркером бурых адипоцитов бурой жировой ткани и образующихся бурых (бежевых) адипоцитов белой жировой ткани. Одно- и двукратная обработка МСК норадреналином показала (Рис 7, Б), что что только при двукратной обработке с интервалом в 6 часов повышается уровень экспрессии UCP1. Это значит, что программа по активации синтеза UCP1 запускается только после реализации гетерологической сенситизации в МСК. Это существенно контрастирует с градуальным снижением уровня маркеров адипогенной дифференцировки адипонектина и PPARg. Двукратное действие добутамина подавляло экспрессию UCP1, что опять же контрастирует с влиянием агонистов на маркеры белого жира, когда эффект норадреналина полностью воспроизводился бета-агонистами. Различные комбинации агонистов адренорецепторов показали, что только комбинация добутаминфенилэфрин, которая специфически имитирует гетерологическую сенситизацию, вызывает эффект, аналогичный двукратному действию норадреналина. Таким образом, гетерологическая сенситизация МСК, осуществляемая перед запуском адипогенной дифференцировки, направляет клетки в сторону дифференцировки в бурый жир. Ингибиторный анализ бурой дифференцировки МСК показал (Рис 6, В), что для коммитирования клеток в этом направлении требуется действие норадреналина в присутствии подавленной активности аденилат-циклазы и активация кальциевой сигнализации. При блокировании выхода кальция из эндоплазматического ретикулума стимулирующий эффект норадреналина пропадает. При действии норадреналина или агонистов добутаминфенилэфрин ингибирование активности аденилат-циклазы может происходить за счет десенситизации бета-адренорецепторов, которую мы наблюдали ранее (Tyurin-Kuzmin et al., 2016). Таким образом, гетерологическая сенситизация альфа1-адренорецепторов вызывает коммитирование клеток в направлении бурой дифференцировки. Второй задачей, запланированной на первый год реализации проекта, был подбор условий для анализа адипогенной дифференцировки МСК в режиме реального времени на уровне одиночных клеток. Для выполнения этой задачи мы ставили эксперимент, схема которого показана на Рис 8. Клетки высаживали на культуральные планшеты в плотности, необходимой для прохождения адипогенной дифференцировки. Клетки красили кальций-чувствительным красителем Fluo8 (4 мкМ) в течение 1 часа и после этого под микроскопом стимулировали клетки норадреналином и регистрировали кальциевые ответы на уровне одиночных клеток (Рис 9, верхняя строка). Индивидуальные клетки, ответившие на норадреналин кальциевой сигнализацией, указаны белыми стрелками. После приблизительно 1 часа инкубации с норадреналином клетки отмыли и перевели в среду для адипогенной дифференцирвки. После этого планшет был возвращен под микроскоп, оснащенный инкубатором с увлажнением и подводом газовой смеси. Планшет был позиционирован так, чтобы он вернулся точно на те же позиции, в которых производилась съемка сигнализации. После этого планшет находился под микроскопом в течение двух недель. При этом каждые 3-4 дня фильм останавливали, под ламинаром заменяли среду на новую адипогенную и ставили планшет обратно под микроскоп. Фотографии клеток делали с интервалом 30 мин. Этот интервал был выбран таким, чтобы отдельные клетки не успевали далеко уползти или изменить форму так, что их было бы невозможно идентифицирвать. После окончания съемки фильма мы проследили за дифференцировочной судьбой клеток, ответивших на норадреналин кальцием. Как видно из Рис 10, ни одна клетка, ответившая кальцием на норадреналин, не накопила большое количество жировых капель. Цитоплазма большинства клеток осталась свободной от капель. Таким образом, клетки, отвечающие кальциевой сигнализацией на действие норадреналина. Не дифференцируются в белые адипоциты. Появление в некоторых клетках небольшого количества мелких жировых капель может свидетельствовать о дифференцировке этих клеток в бурые адипоциты, но проверка этого предположения будет произведена во втором году реализации проекта. Таким образом, мы показали, что гетерологическая сенситизация МСК, вызываемая стимуляцией бета-адренорецепторов, которая приводит к потенциации клеток к кальций-зависимому ответу через альфа1А-адренорецепторы, приводит, во-первых, к подавлению дифференцировки МСК в белые адипоциты, которая выражается в снижении уровня экспрессии PPARg и адипонектина и блокировке накопления жировых капель в цитоплазме, во-вторых, к активации дифференцировки клеток в бурые адипоциты, которая выражается в повышении уровня экспрессии UCP1. На уровне одиночных клеток была показана прямая корреляция между кальциевым ответом на норадреналин и отсутствием адипогенной дифференцировки в белый жир. | ||
2 | 9 января 2020 г.-8 декабря 2020 г. | Выяснение диференцировочной судьбы клеток, отвечающих на норадреналин кальцием |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".