ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Проектом предусматривается создание ингибиторов биосинтеза белка, сочетающих в структуре элементы антибактериальных соединений разных классов, и изучение комплексов этих соединений с рибосомой с целью определения тонких механизмов регуляции и функционирования рибосомы. Комбинирование в структуре потенциального антибиотика разных фармакофоров может привести к увеличению сродства соединения к рибосоме, изменению селективности и специфичности действия на рибосомы по сравнению с исходными антибиотиками, а также получению ингибиторов роста резистентных штаммов бактерий. Определение этих свойств в сочетании с данными компьютерного моделирования комплексов ингибиторов с рибосомой методами молекулярного докинга и молекулярной динамики, а также структурными данными, позволят определить контакты между элементами ингибитора и участками рибосомы при их взаимодействии. Ингибиторы биосинтеза белка, направленные одновременно на разные регуляторные участки рибосомного туннеля (РТ) и пептидилтрансферазного центра (ПТЦ), планируется сконструировать на основе макролидов семейства тилозина, антибактериальных пептидов, способных взаимодействовать с рибосомой в области ПТЦ и РТ (онкоцинов), хлорамфеникола и гидрофобных проникающих катионов (трифенилфосфония, карнитина, родамина). В структуре новых соединений будет присутствовать рибосомный антибиотик (макролид или хлорамфеникол), с одной стороны, и фрагмент другого биологически активного соединения, такой как, N- либо С-концевая последовательность онкоцина, или алкильное производное проникающего катиона, с другой стороны. Соединение в целом должно образовывать прочные комплексы с рибосомой за счет антибиотика, выполняющего роль «якоря», доставляющего молекулы в определенный сайт рибосомы. Другая часть соединения (пептидная цепочка или катион) должны взаимодействовать при этом с другими функционально-важными сайтами РТ или ПТЦ. Исследование взаимодействия с рибосомой предлагаемых в данном проекте двухсайтовых ингибиторов биосинтеза белка в сочетании с ранее полученными результатами позволит приблизиться к пониманию процесса передачи сигналов от элементов РТ к ПТЦ и регуляции процесса трансляции.
New synthetic analogs of ribosomal antibiotics desmycosin and chloramphenicol containing either amino acids or hydrophobic penetrating triphenylphosphonium cations have been synthesized. The analogs were preliminary constructed by means of a computer simulation based on available X-ray data of bacterial ribosome complexes with macrolides, chloramphenicol and antimicrobial peptide oncocin 112. The simulation process was performed using the three-dimensional structures of complexes between nascent-peptide chain exit tunnel (NPET) or peptidyl transferase center (PTC) and analogs of antibiotics, that are macrolides or chloramphenicol modified by peptide fragments of oncocin or hydrophobic penetrating cations. We used both experimental (competition-binding assay, in vitro bacterial and eukaryotic translation assay, antibacterial activity on double reporter system with pDualrep2, toxicity towards gram-positive and gram-negative bacteria, toe-printing assay, X-ray structural analysis) and computational (molecular docking, molecular dynamics) methods in order to investigate interaction between obtained analogs of antibiotics and bacterial ribosome. It was shown using competition-binding assay with fluorescent erythromycin analog that desmycosin and chloramphenicol derivatives with oncocin peptide fragments are able to bind to bacterial ribosome. The double reporter system with pDualrep2 revealed that these analogs inhibit bacterial peptide synthesis as well. The tripenylphosphonium analogs of chloramphenicol bind to bacterial ribosome and exhibit antibacterial activity in vitro against gram-positive and gram-negative strains, which include chloramphenicol resistant ones. The X-ray diffraction assay of complex between T. thermophilus ribosome and triphenylphosphonium analog of chlorampenicol with butyl linker was performed. It was revealed that the binding position of the amphenicol part is same to those for complexes with chloramphenicol whereas alkyl linker and triphenylphosphonium group are oriented toward the NPET. The primer extension inhibition assay (toe-printing) showed that thiphenylposphoium analogs of chloramphenicol arrest translation at the start codon or at the several codons after translation had started. Furthermore, translation inhibitory activity of thiphenylposphoium analogs of chloramphenicol depends on peptide sequence encoded in mRNA. The molecular dynamic modeling of 70S E.coli ribosome complexes with triphenylphosphonium anologs containing both fMet-tRNA in the P-site and mRNA allowed explaining the results of toe-printing assay. It were demonstrated that triphenylphosphonium analogs are able to bind in an “alternative” binding site of chloramphenicol, while amphenicol part interacts with Ψ2504, U2506 and G2061 nucleotides. Whereby the alkyltriphenylphosphonium group is oriented toward the NPET and is able to interact with nascent peptide chain during translation process. Therefore, analogs of chloramphenicol do not only arrest translation at the start codon but at next codons, allowing synthesis of short peptides, and their length depends on either a peptide sequence and a length of an alkyl linker of the chloramphenicol analog. All intended goals are reached. It is shown that all designed and synthesized two-sites protein biosynthesis inhibitors can be successfully used for translation mechanism study.
Общий план работы на весь срок выполнения проекта. - На основании доступных данных рентгеноструктурного анализа комплексов антибиотиков групп макролидов и амфеникола, а также онкоцина 112 с бактериальными рибосомами выполнить компьютерное моделирование трехмерной структуры комплексов макролидов и хлорамфеникола, модифицированных пептидными фрагментами онкоцинов либо гидрофобными проникающими катионами, с рибосомным туннелем и ПТЦ и осуществить выбор оптимальных линкеров для присоединения заместителей. - Осуществить синтез пептидных фрагментов онкоцинов определенной последовательности и длины. - Осуществить синтез пептидных производных десмикозина и хлорамфеникола, в структуре которых будут присутствовать N- либо С-концевые фрагменты онкоцинов. - Осуществить синтез производных макролидов, содержащих гидрофобные катионы (трифенилфосфоний, родамин, карнитин). - Определить константы связывания полученных производных с рибосомой методом конкурентного вытеснения флуоресцентно-меченных антибиотиков. - Проверить токсическое действие полученных ингибиторов на грамположительные и грамотрицательные на различных штаммах Bacillus Subtilis и Escherichia coli, в том числе ?TolC-штаммах. - Проверить эффективность ингибирования биосинтеза белка полученными конъюгатами в системе трансляции Fluc мРНК. - Протестировать синтезированные производные на антибактериальную активность, в том числе на резистентных к макролидам штаммах. - Провести рентгеноструктурные исследования комплексов ингибиторов, проявивших наиболее интересные свойства, с рибосомами Thermus thermophilus. - Осуществить моделирование комплексов синтезированных ингибиторов с бактериальными рибосомами методом молекулярного докинга и молекулярной динамики.
Коллектив имеет достаточный научный задел для выполнения данного проекта . В группе синтетических исследований хорошо разработан синтез различных природных пептидов и пептидомиметиков. Освоены методы синтеза пептидов на твердой фазе и в растворе, методы конъюгации аминокислот и пептидов с антибиотиками тилозинового ряда, хлорамфениколом, цефалотаксином. Разработаны методы конденсации альдегид-содержащих соединений с пептидами посредством тиазолидиновых, оксимино- и гидразиновых линкеров, методы селективной модификации гидроксильных групп, а также очистки и идентификации различных гибридных структур. К настоящему времени коллективом заявителей проекта получены новые аминокислотные и пептидные производные антибиотиков-макролидов семейства тилозина, ряд производных эритромицина, а также хлорамфеникола и цефалотаксина. Показано, что полученные аналоги связываются в РТ, при этом пептидные и аминокислотные заместители вступают во взаимодействие с элементами рРНК, а также проявляют ингибирующую и антибио тическую активность, сравнимую с таковой у немодифицированных антибиотиков. Нами разработана и успешно применена методика для оценки связывания производных антибиотиков и других лигандов в РТ на основе метода поляризации флуоресценции, для этого получен ряд флуоресцентных производных макролидов, изучено их связывание с рибосомами E.coli и выбраны подходящие флуоресцентные соединения для вытеснения их из комплексов с бактериальными рибосомами. В коллективе накоплен десятилетний опыт синтеза, анализа, очистки и биохимических исследований оригинальных соединений, в структуру которых входят гидрофобные проникающие катионы, аклкильные цепи и хиноновые радикалы. В частности, имеется опыт исследования действия этих соединений на бактериях различных штаммов Bacillus Subtilis и Escherichia coli. Имеется опыт молекулярно-динамических исследований комплексов макролидов, хлорамфеникола, их аминокислотных и пептидных производных с РТ бактериальных рибосом.
Синтетическим путем получен ряд новых аналогов рибосомных антибиотиков десмикозина и хлорамфеникола, содержащих в структуре либо фрагменты антимикробных пептидов, либо гидрофобные проникающие катионы. Аналоги были предварительно сконструированы на основании доступных данных рентгеноструктурного анализа комплексов антибиотиков групп макролидов и амфеникола, а также онкоцина 112 с бактериальными рибосомами с помощью компьютерного моделирования трехмерной структуры комплексов макролидов и хлорамфеникола, модифицированных пептидными фрагментами онкоцинов либо гидрофобными проникающими катионами, с рибосомным туннелем и ПТЦ. Взаимодействие полученных аналогов антибиотиков с бактериальными рибосомами изучали экспериментальными (определение связывания с рибосомами, ингибирование трансляции ин витро, антибиотическая активность в двойной репортерной системе, токсичность в отношении бактерий, бацилл и эукариотических клеток, ту-принтинг, РСА комплексов с рибосомами) и расчетными методами (молекулярный докинг, молекулярная динамика). Методом конкурентного вытеснения флуоресцентно-меченного эртромицина из его комплексов с рибосомой E. coli показано, что производные десмикозина и хлорамфеникола, содержащие в структуре фрагменты антимикробного пептида онкоцина, способны связываться с бактериальными рибосомами. Показано также, что эти аналоги проявляют антибиотическую активность, связанную с остановкой трансляции в двойной репортерной системе pDualrep2. Показано, что трифенилфосфониевые аналоги хлорамфеникола связываются с бактериальными рибосомами, а также проявляют антибиотическую активность в тестах in vitro и в культурах грам-положительных грам-отрицательных бактерий, в том числе на устойчивых к хлорамфениколу штаммах. Методом РСА исследованы комплексы трифенилфосфониевого аналога хлорамфеникола, САМ-С4-ТРР, с рибосомами T. thermophilus (Yu. Polikanov lab., University of Illinois at Chicago, USA). По данным РСА в этих комплексах амфеникольная часть расположена так же, как и в комплексах с хлорамфениколом, алкильный мостик и трифенилфосфониевая группировка направлены в просвет туннеля. С помощью анализа ингибирования биосинтеза белка по удлинению праймера (ту-принтинг) с использованием трех мРНК показано, что ингибирующее трансляцию действие трифенилфосфониевых аналогов хлорамфеникола связано с остановкой трансляции как на стартовом кодоне, так и еще на нескольких шагах трансляции, причем действие аналогов зависит от последовательности закодированного в мРНК пептида. Результаты, полученные методом ту-принтинга, удалось отчасти объяснить с помощью моделирования комплексов 70S рибосом E.coli, содержащих fMet-тРНК в P,P-состоянии и мРНК, с трифенилфосфониевыми аналогами хлорамфеникола методами молекулярной динамики. Показано, что трифенилфосфониевые аналоги способны располагаться в «альтернативном» сайте связывания хлорамфеникола, при этом амфеникольная часть аналогов взаимодействует с основаниями Ψ2504, U2506 и G2061, а алкилтрифенилфосфониевая часть молекулы направлена в просвет рибосомного туннеля и может взаимодействовать с пептидной цепью в ходе трансляции. Находясь в этом сайте, аналоги хлорамфеникола могут блокировать трансляцию не на первом шаге, а допускать синтез коротких пептидов, причем длина этих пептидов может быть разной и зависеть, как от последовательности пептида, так и от длины алкильного мостика в трифенилфосфониевом аналоге хлорамфеникола. Все запланированные результаты получены. Показано, что все сконструированные и синтезированные в данном проекте двухсайтовые ингибиторы могут быть успешно использованы для изучения механизмов регуляции трансляции.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 18 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Двухсайтовые ингибиторы биосинтеза белка как инструменты изучения механизма трансляции |
Результаты этапа: Задачей исследования является создание ингибиторов биосинтеза белка бактерий, направленных одновременно на разные регуляторные участки рибосомного туннеля (РТ) и пептидилтрансферазного центра (ПТЦ). Ингибиторы сконструированы на основе соединений разных классов: макролидов семейства тилозина, антибактериальных пептидов, способных взаимодействовать с рибосомой в области ПТЦ и РТ, (онкоцинов), хлорамфеникола и гидрофобных проникающих катионов (трифенилфосфония, карнитина, родамина). В структуре новых соединений должен присутствовать рибосомный антибиотик (макролид или хлорамфеникол), с одной стороны, и фрагмент другого биологически активного соединения, такой как, N- либо С-концевая последовательность онкоцина, или алкильное производное проникающего катиона, с другой стороны. Антибиотики группы тилозина связываются в верхней части РТ в высокоаффинном центре взаимодействия макролидов с рибосомой , расположенном на расстоянии примерно 20 А от ПТЦ, хлорамфеникол взаимодействует с большой субъединицей рибосомы в области А-сайта ПТЦ таким образом, что его дихлорацетильный ос таток направлен в сторону РТ. Соединение в целом должно образовывать прочные комплексы с рибосомой за счет антибиотика, выполняющего роль «якоря», доставляющего молекулы в определенный сайт рибосомы. Другая часть соединения (пептидная цепочка или катион ) должны взаимодействовать при этом с другими функционально -важными сайтами РТ или ПТЦ. Выбор такого рода заместителей основывается как на литературных данных последних лет, так и на наших собственных результатах, касающихся взаимодействия элементов рибосомного туннеля с боковыми цепями растущей полипептидной цепи, а также аминокислотных и пептидных производных макролидов и хлорамфеникола. В частности, представляет интерес исследование области взаимодействия фрагментов онкоцинов с элементами РТ и ПТЦ, выявление роли отдельных остатков пептидной цепи и рРНК в этих взаимодействиях. Область связывания онкоцинов перекрывается с областями связывания как макролидов, так и хлорамфеникола, что позволит сочетать в рамках одной молекулы N-концевую часть пептида, направленную при взаимодействии с РТ в сторону ПТЦ, и макролид (десмикозин), либо С-концевую часть онкоцина, направленную в сторону выхода из туннеля, и хлорамфеникол, таким образом, чтобы пептидные фрагменты в гибридной молекуле располагались в РТ так же, как и при связывании онкоцина. Ранее нами были выявлены производные макролидов и хлорамфеникола, содержащие в структуре положительно заряженные группы (карнитин, гистидин) и обладающие высоким сродством к рибосоме. С другой стороны, известно, что гидрофобные катионы, такие как трифенилфосфоний или родамин 19, в которых положительный заряд делокализован, способны взаимодействовать как с анионами, так и с гидрофобным окружением, например, проходить сквозь липидные мембраны. Поскольку стенки РТ сформированы, в основном, нуклеотидными остатками рРНК, причем таким образом, что большинство из них обращены в сторону туннеля гетероциклическими основаниями, а в тоже время, сахаро -фосфатный остов рРНК, расположенный вблизи стенок туннеля, создает в РТ отрицательный потенциал, который распределен вдоль РТ неравномерно , для лиганда, находящегося внутри туннеля, создается возможность образования гидрофобных и электростатических контактов. Использование гидрофобных проникающих катионов в сочетании с рибосомными антибиотиками в рамках одной молекулы (макролидами, хлорамфениколом) может позволить обнаружить как области специфичных, так и неспецифичных контактов в РТ. Исследование взаимодействия с рибосомой предлагаемых в данном проекте двухсайтовых ингибиторов биосинтеза белка в сочетании с ранее полученными нами результатами позволит приблизиться к пониманию процесса передачи сигналов от элементов РТ к ПТЦ и регуляции процесса трансляции. В 2016 году на основании доступных данных рентгеноструктурного анализа комплексов антибиотиков групп макролидов и амфеникола, а также онкоцина 112 с бактериальными рибосомами с помощью программы PyMol выполнено компьютерное моделирование трехмерной структуры комплексов макролидов и хлорамфеникола, модифицированных пептидными фрагментами онкоцинов либо гидрофобными проникающими катионами, с рибосомным туннелем и ПТЦ и осуществилен выбор линкеров для присоединения заместителей. Показано, что расстояние от карбоксила Leu7 онкоцина112 до 4’-ОН-группы десмикозина составляет около 3.5 A, а от Tyr6 – около 5 А. Т.о., в первом случае в качестве линкера может выступать Gly или βAla, а во втором – гамма-аминомасляная кислота. Осуществлен синтез серии пептидил-полимеров, соответствующих фрагментам онкоцина 112: 1-6, 2-6, 3-6, 4-6 и 5-6 (VDKPPY, DKPPY, KPPY, PPY и PY), и предназначенных для конъюгации с десмикозином. В качестве полимера использовали 2-хлортритил-полимер, который позволяет получать пептиды, защищенные по N-концевой аминогруппе и боковым функциональным группам. Осуществлен синтез производного десмикозина, защищѐнного по всем реакционноспособным гидроксильным группам, кроме 4-ОН группы микаминозы. Полученное производное модифицировано с помощью гамма-аминомасляной кислоты, путем присоединения Вос-гамма-аминомасляной кислоты к 4-ОН-группе десмикозина с последующим деблокированием аминогруппы, предназначенной для дальнейшей конъюгации с пептидами. Ключевое для дальнейшего синтеза соединение получено в препаративных количествах. Осуществлен синтез новых аналогов хлорамфеникола, содержащих трифенилфосфоний, соединенный с аминогруппой хлорамфениколамина линкерами различной длины. Аналоги получали присоединением (4-карбоксибутил)(трифенил)фосфония либо (10-карбоксидецил)(трифенил)фосфония к аминогруппе хлорамфениколамина (CAM-C4-TPP и CAM-C10-TPP ). Проведены предварительные опыты по определению констант связывания трифенилфосфониевых аналогов хлорамфеникола с рибосомой E. coli методом конкурентного вытеснения флуоресцентно-меченного эртромицина (BODIPY-Ery). Определение констант было затруднено значительным ростом исходного уровня флуоресценции, предположительно обусловленного взаимодействием трифенилфосфониевой группировки с элементами рибосомы. Предварительно вычисленные константы диссоциации комплексов рибосом E. coli с обоими производными оказались на уровне 0,4 мкмоль. Т.о. сродство трифенилфосфониевых аналогов хлорамфеникола к бактериальным рибосомам примерно в 3-4 раза выше, чем хлорамфеникола. Токсическое действие полученных трифенилфосфониевых аналогов хлорамфеникол, а также производных антибиотиков группы тилозина, содержащих в п. 6 карнитиновую группировку, либо остаток родамина В, на грамположительные и грамотрицательные бактерии проверяли на штаммах Bacillus Subtilis и Escherichia coli, в том числе на dTolC-штаммах. На бациллах карнитиновое производное тилозина (Tyl-Car) демонстрирует активность, превышающую активность самого тилозина в 2 раза. (>2uM для тилозина, 1uM для Tyl-Car), тогда как родаминовое производное значительно уступает тилозину. Соединение CAM-C4-TPP также значительно уступало в этом виде активности исходному антибиотику. В отличие от CAM-C4-TPP, производное с более длинным линкером (CAM-C10-TPP) подавляет рост бацилл в концентрациях на порядок ниже концентрации хлорамфеникола (0,5 uM и 5uM , соответственно). В отношении штаммов WT и дельта-TolC- E.coli оказалось, что хотя активность САМ-С10-ТРР значительно уступает хлорамфениколу иС12ТРР (который был использован в качестве контроля), как на штамме дикого типа, так и на мутантном, интересным оказался тот факт, что TolC участвует в выбросе из клеток и хлорамфеникола, и CAM-C10TPP. Этот процесс осуществляется AcrAB-TolC помпой, но осуществляется по-разному для каждого из этих соединений. Осуществлено моделирование комплексов онкоцина 112 с бактериальными рибосомами методом молекулярной динамики. Расчеты взаимодействия онкоцинов с бактериальными рибосомами основывались на комплексе с T. thermophilus (код PDB: 4Z8C). Пептид длиной 13 остатков (N) H-Val1-Asp2-Lys3-Pro4-Pro5-Tyr6-Leu7-Pro8-Arg9-Pro10-Arg11-Pro12-Pro13-NH2 (C) вводился в систему с кодом PDB: 3OFR с добавлением модифицированных оснований. Были получены две траектории, 202 нс и 194 нс. Расчеты выполнялись на суперкомпьютерах «Ломоносов» и «Ломоносов -2». В результате анализа траекторий показано, что карбонильная группа Leu7 дает исключительно стабильную водородную связь с U2585, Tyr6 - с G2061, Arg9 взаимодействует с C2610. В целом, показано, что мотив 3-10 (KPPYLPRP) наиболее важен для связывания онкоцинов с рибосомой. | ||
2 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Двухсайтовые ингибиторы биосинтеза белка как инструменты изучения механизма трансляции |
Результаты этапа: Проект направлен на решение фундаментальной проблемы молекулярной биологии и биохимии - изучение механизма функционирования рибосомы. Проектом предусматривается создание ингибиторов биосинтеза белка, сочетающих в структуре элементы антибактериальных соединений разных классов, и изучение комплексов этих соединений с рибосомой с целью определения тонких механизмов регуляции и функционирования рибосомы. Комбинирование в структуре потенциального антибиотика разных фармакофоров может привести к увеличению сродства соединения к рибосоме, изменению селективности и специфичности действия на рибосомы по сравнению с исходными антибиотиками, а также получению ингибиторов роста резистентных штаммов бактерий. Определение этих свойств в сочетании с данными компьютерного моделирования комплексов ингибиторов с рибосомой методами молекулярного докинга и молекулярной динамики, а также структурными данными, позволят определить контакты между элементами ингибитора и участками рибосомы при их взаимодействии. Задачей исследования является создание ингибиторов биосинтеза белка бактерий, направленных одновременно на разные регуляторные участки рибосомного туннеля (РТ) и пептидилтрансферазного центра (ПТЦ). Ингибиторы сконструированы на основе соединений разных классов: макролидов семейства тилозина, антибактериальных пептидов, способных взаимодействовать с рибосомой в области ПТЦ и РТ (онкоцинов), хлорамфеникола и гидрофобных проникающих катионов (трифенилфосфония, карнитина, родамина). В 2017 году закончен синтез серии N-концевых фрагментов онкоцина112, предназначенных для конъюгации с десмикозином. Осуществлен синтез серии новых пептидных аналогов десмикозина, содержащих N-концевые фрагменты антимикробного пептида онкоцина (Onc 112). Синтезированы новые аналоги хлорамфеникола, содержащие короткие С-концевые фрагменты онкоцинов, а также новый трифенилфосфониевый аналог с удлиненным по сравнению с ранее полученными аналогами линкером, соединяющим трифенилфосфоний с аминогруппой хлорамфениколамина. Определены константы связывания полученных ключевых ацетилированных производных десмикозина с рибосомой E. coli методом конкурентного вытеснения флуоресцентно-меченного эртромицина, показано, что эти производные обладают достаточно высоким сродством к бактериальным рибосомам для того, чтобы могли быть изучены взаимодействия элементов рибосомного туннеля с онкоциновыми фрагментами сконструированных на их основе пептидных производных. Трифенилфосфониевые аналоги хлорамфеникола были исследованы на антибиотическую активность в двойной репортерной системе pDualrep2, было показано, что в отличие от алкил(трифенил)фосфониевых соединений механизм их действия связан с подавлением трансляции бактериальных белков. Было продолжено исследование токсического действия полученных трифенилфосфониевых аналогов хлорамфеникола, а также производных антибиотиков группы тилозина на грам-положительные и грам-отрицательные бактерии; показано, что трифенилфосфониевые аналоги с «длинными» линкерами (С10, С14) превосходят по ингибирующей активности хлорамфеникол на культурах Mycobacterium sp., Staphylococcus aureus и Bacillus subtilis. Осуществлено моделирование комплексов тилозина и его восстановленного по альдегидной группе производного с бактериальными рибосомами методом молекулярной динамики. | ||
3 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Двухсайтовые ингибиторы биосинтеза белка как инструменты изучения механизма трансляции |
Результаты этапа: Синтетическим путем получен ряд новых аналогов рибосомных антибиотиков десмикозина и хлорамфеникола, содержащих в структуре либо фрагменты антимикробных пептидов, либо гидрофобные проникающие катионы. Аналоги были предварительно сконструированы на основании доступных данных рентгеноструктурного анализа комплексов антибиотиков групп макролидов и амфеникола, а также онкоцина 112 с бактериальными рибосомами с помощью компьютерного моделирования трехмерной структуры комплексов макролидов и хлорамфеникола, модифицированных пептидными фрагментами онкоцинов либо гидрофобными проникающими катионами, с рибосомным туннелем и ПТЦ. Взаимодействие полученных аналогов антибиотиков с бактериальными рибосомами изучали экспериментальными (определение связывания с рибосомами, ингибирование трансляции ин витро, антибиотическая активность в двойной репортерной системе, токсичность в отношении бактерий, бацилл и эукариотических клеток, ту-принтинг, РСА комплексов с рибосомами) и расчетными методами (молекулярный докинг, молекулярная динамика). Методом конкурентного вытеснения флуоресцентно-меченного эртромицина из его комплексов с рибосомой E. coli показано, что производные десмикозина и хлорамфеникола, содержащие в структуре фрагменты антимикробного пептида онкоцина, способны связываться с бактериальными рибосомами. Показано также, что эти аналоги проявляют антибиотическую активность, связанную с остановкой трансляции в двойной репортерной системе pDualrep2. Показано, что трифенилфосфониевые аналоги хлорамфеникола связываются с бактериальными рибосомами, а также проявляют антибиотическую активность в тестах in vitro и в культурах грам-положительных грам-отрицательных бактерий, в том числе на устойчивых к хлорамфениколу штаммах. Методом РСА исследованы комплексы трифенилфосфониевого аналога хлорамфеникола, САМ-С4-ТРР, с рибосомами T. thermophilus (Yu. Polikanov lab., University of Illinois at Chicago, USA). По данным РСА в этих комплексах амфеникольная часть расположена так же, как и в комплексах с хлорамфениколом, алкильный мостик и трифенилфосфониевая группировка направлены в просвет туннеля. С помощью анализа ингибирования биосинтеза белка по удлинению праймера (ту-принтинг) с использованием трех мРНК показано, что ингибирующее трансляцию действие трифенилфосфониевых аналогов хлорамфеникола связано с остановкой трансляции как на стартовом кодоне, так и еще на нескольких шагах трансляции, причем действие аналогов зависит от последовательности закодированного в мРНК пептида. Результаты, полученные методом ту-принтинга, удалось отчасти объяснить с помощью моделирования комплексов 70S рибосом E.coli, содержащих fMet-тРНК в P,P-состоянии и мРНК, с трифенилфосфониевыми аналогами хлорамфеникола методами молекулярной динамики. Показано, что трифенилфосфониевые аналоги способны располагаться в «альтернативном» сайте связывания хлорамфеникола, при этом амфеникольная часть аналогов взаимодействует с основаниями Ψ2504, U2506 и G2061, а алкилтрифенилфосфониевая часть молекулы направлена в просвет рибосомного туннеля и может взаимодействовать с пептидной цепью в ходе трансляции. Находясь в этом сайте, аналоги хлорамфеникола могут блокировать трансляцию не на первом шаге, а допускать синтез коротких пептидов, причем длина этих пептидов может быть разной и зависеть, как от последовательности пептида, так и от длины алкильного мостика в трифенилфосфониевом аналоге хлорамфеникола. Все запланированные результаты получены. Показано, что все сконструированные и синтезированные в данном проекте двухсайтовые ингибиторы могут быть успешно использованы для изучения механизмов регуляции трансляции. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".