ИСТИНА

В рамках проекта созданы оригинальные аптамерные наноконструкции с G- квадруплексными межмолекулярными « замками» . Предложена серия потенциальных G- квадруплексных замков, линкерных последовательностей и готовых наноконструкций на основе ДНК -аптамера к тромбину 15- ТВА. Выбрана и проанализирована бимолекулярная конструкция GL несколькими физико - химическими методами. Для определения топологии выбранной конструкции были использованы следующие методы: спектроскопия кругового дихроизма, капиллярный электрофорез, динамическое светорассеяние и атомно - силовая микроскопия. Совокупностью методов показано, что аптамер GL является преимущественно олигомерным олигонуклеотидом. Исходя из совокупности данных, можно заключить, что конструкция является бимолекулярной. Для доказательства сохранения функциональной активности аптамера были использованы энзиматические тесты: турбидиметрический/энзиматический метод и коагуляционные тесты. Показано, что функциональная активность аптамера к тромбину в процессе создания наноконструкции полностью сохранилась.

The project created the original nanoconstructs with G - quadruplex intermolecular locks. The series of potential G - quadruplex locks, linker sequences and complete nanostructures were proposed based on the DNA of the thrombin aptamer 15 - TBA. Selected bimolecular construction, GL, was analized with several physico - chemical methods. To define the topology of the chosen design were used the following methods: circular dichroism spectroscopy, capillary electrophoresis, dynamic light scattering and atomic force microscopy. Using the methods it was shown that the aptamer GL is predominantly oligomeric oligonucleotide. Based on the totality of the data, we can conclude that the construct is bimolecular. For the proof of preservation of functional activity of the aptamer was used in enzymatic tests: turbidimetric/enzyme method and coagulation tests. It is shown that the functional activity of the aptamer to thrombin in the process of creating nanoconstructs completely preserved.

1) Выбор G-богатых последовательностей, образующих димеры, тетрамеры или олигомерные G-квадруплексы на основе данных литературы и молекулярного моделирования 2) Создание конструкции, состоящих из аптамера к тромбину 15-ТВА, линкера и G-богатых последовательностей 3) Изучение конструкций спектроскопией кругового дихроизма 4) Изучение конструкций капиллярным электрофорезом 5) Изучение конструкций динамическим светорассеянием 6) Изучение конструкций атомно-силовой микроскопией 7) Изучение конструкций турбидиметрическим методом 8) Изучение конструкций коагулометрическим методом

Авторы проекта имеют большой научный задел по проекту, который позволяет им корректно ставить и решать задачи. Для данного проекта существенное значение имеют следующие новые и оригинальные методы. Разработаны оригинальные методики анализа структуры и функции аптамеров. Разработан новый турбидиметрический метод, созданный авторами проекта специально для изучения кинетики ингибирования тромбина аптамерными олигонуклеотидами. Например, авторами проекта методами кругового дихроизма и турбидимитрическим анализом показана ключевая роль оснований петель ТТ и TGT аптамера 15-ТВА для связывания стабилизирующих ионов K+ и ингибирующей активности аптамера. Описано влияние природы и концентрации двух и одновалентных катионов на структуру и функциональную активность G-квадруплексных аптамеров. Показано, что функциональная активность G-квадруплексов аптамеров к тромбину возможна только в присутствии катионов калия и натрия. Описаны структура и характер взаимодействия структурных модулей двухмодульного аптамера к тромбину 31-ТВА, состоящего из G-квадруплекса, дуплекса и соединяющих петель. Отработаны способы оценки сборки мономолекулярных и межмолекулярных G-квадруплексов. отработаны концентрации катионов, ускоряющих сборку G-квадруплексов. Изучена термическая стабильность мономолеклярных и межмолекулярных G-квадруплексов. На ряд аптамеров получены патенты, в том числе международные. Проведены первые работы по созданию наноконструкций на основе ДНК. В качестве аптамера был выбран аптамер к тромбину 15-ТВА, к нему была добавлена G-богатая последовательность, склонная образовывать димерные G-квадруплексы. Показано, что добавление таких последовательностей на один из концов аптамера 15-ТВА не оказывает негативного влияния на ингибирующую активность и специфичность аптамера. В то же время, аптамер с дополнительной последовательностью образует ассоциаты (предположительно, димерные), обладающие большим радиусом гирации, чем мономерный олигонуклеотид.