ИСТИНА

Были проанализированы факторы, предопределяемые составом применяемых сред, способствующие повышению уровня эффективности использования биокаталитических систем в виде иммобилизованных клеток микроорганизмов (концентрация сахаров и концентрация веществ-ингибиторов микроорганизмов). Установлено, что иммобилизованные клетки – продуцентов полисахаридов более устойчивы к высоким концентрациям субстратов и веществ-ингибиторов в составе питательных сред на основе гидролизатов различного сырья, в сравнении со свободными клетками. Исследовано влияние характеристик применяемых сред и природы исходных субстратов, источником которых являются предобработанная различными физико-химическими и биохимическими методами разнообразная биомасса, на реологические характеристики носителя, применяемого для получения иммобилизованных форм клеток-продуцентов. Показано, что криогель поливинилового спирта химически инертен и его свойства не изменяются в течение как минимум 10 рабочих циклов. В случае иммобилизации дрожжеподобных грибов Auerobasidium pullulans – продуцентов пуллулана установлено, что прорастающие споры в процессе формирования биокатализатора дополнительно армируют матрицу носителя. Исследованы и проанализированы зависимости основных характеристик процесса биосинтеза полисахаридов с участием разных иммобилизованных клеток (ИБК) от условий проведения процесса, не относящихся к составу сред. Выявлено, что иммобилизация позволяет увеличить скорость потребления субстратов клетками и повысить выход конечных продуктов, снизить влияние рН среды, температуры, значительно продлить временной интервал эффективного использования одних и тех же клеток в сравнении с суспензионными, взятыми в тех же концентрациях. Проведение процесса биосинтеза полисахаридов в режиме с подпитками позволяет увеличить их выход. Обобщены полученные результаты исследований с целью выявления общих тенденций развития разных процессов и установления наличия специфических отличий, характерных для каждой из исследованных биокаталитических систем. Установлено, что скорости накопления полисахаридов под действием иммобилизованных клеток выше в 1,2-3,6 раза, чем у суспензионных клеток, используемых в аналогичных условиях. Применение ИБК позволило сократить в 1,4-1,6 раза длительность рабочих циклов клеток при синтезе ими полисахаридов с выходом, превышающим аналогичный параметр у свободных клеток. Был проведен анализ образцов полисахаридов, полученных с использованием иммобилизованных клеток бактерий и дрожжей. Установлено, что образцы декстрана, производимые ИБК, имеют меньшую молекулярную массу по сравнению с полисахаридом, синтезируемым свободными клетками. Показано, что бактериальная целлюлоза, секретируемая ИБК, обладает более высокими прочностными характеристиками, чем тот же полимер, синтезированный свободными клетками. Аналогичная тенденция отмечена и при переходе от питательных сред на основе чистых сахаров к питательным средам на основе гидролизатов различных отходов. Таким образом, можно утверждать, что иммобилизация продуцентов полисахародов и изменение состава питательных сред являются методами управления характеристик конечных продуктов. Дополнительно, исследовался биокатализатор в виде иммобилизованных клеток Azotobacter vinelandii – продуцентов альгината, метаболизм которого в клетках схож с синтезом бактериальной целлюлозы. Разработка и использование в исследованиях образцов ИБК позволили еще раз подтвердить универсальность предлагаемого подхода. При этом показано, что синтеза полисахаридов контролируется проявлением такого явления как кворумный ответ клеток, причем как у про-, так и эукариотов, а иммобилизация клеток позволяет создавать и удерживать клетки в состоянии кворума.

Development and research process of polysaccharides biocatalytic synthesis

. Исследовать и провести анализ факторов, предопределяемых составом применяемых сред, способствующих повышению уровня эффективности использования биокаталитических систем в виде иммобилизованных клеток микроорганизмов, и установить их влияние на основные характеристики процессов и самих биокатализаторов (скорость трансформации субстратов в целевые продукты конверсии, субстратную специфичность, эффективность и стабильность функционирования при использовании разных субстратов). Исследовать влияние характеристик применяемых сред и природы исходных субстратов, источником которых являются предобработанная различными физико-химическими и биохимическими методами разнообразная биомасса, на реологические характеристики носителя, применяемого для получения иммобилизованных форм клеток-продуцентов. 2. Исследовать и проанализировать зависимости основных характеристик процесса биосинтеза полисахаридов с участием разных иммобилизованных клеток (выход биополимера, скорость процесса, максимальная концентрация накапливающегося полисахарида) от условий проведения процесса, не относящихся к составу сред, в частности, от длительности процесса, температурного режима и режима аэрации, концентрации иммобилизованных клеток в среде, ведение процесса с внесением подпиток и др. 3. Обобщить полученные результаты исследований с целью выявления общих тенденций развития разных процессов и установить наличие специфических отличий, характерных для каждой из исследованных биокаталитических систем. Выделить общие закономерности в функционировании разных биокатализаторов на основе клеток различных микроорганизмов в системах получения высокомолекулярных полисахаридов, а также закономерности влияния иммобилизации на функционирование клеток в данных системах в целом. 5. Провести анализ образцов полисахаридов, полученных с использованием иммобилизованных клеток бактерий и дрожжей, установить зависимости свойств полученных биополимеров (молекулярной массы, реологических характеристик) от исходного состава сред, применявшихся для культивирования клеток-продуцентов, в виде различных отходов, предобработанных разными физико-химическими и биохимическими методами. 6. Провести систематизацию результатов и установить наличие зависимости свойств целевых метаболитов, получаемых в виде полигидроксиалканоатов, пуллулана и целлюлозы, от состава тех субстратов, которые могут быть вовлечены в процессы получения биодеградируемых полимеров, являясь отходами биомассы различного происхождения. Разработать стратегию получения биополимеров с определёнными характеристиками путём корректировки состава сред, применяемых для культивирования иммобилизованных клеток бактерий и дрожжей. 7. Используя полученную информацию об основных закономерностях в изменении характеристик процессов получения полисахаридов с участием разработанных биокаталитических систем, экспериментально показать возможность управления свойствами синтезируемых полимеров, подготовить образцы биополимеров и подтвердить их характеристики известными методами. 8. Подготовить публикации в рецензируемые научные издания, а также патентные заявки на изобретения по полученным результатам, представить результаты, не подлежащие патентованию, на международных научных форумах, с целью их популяризации.

У исполнителей проекта имеется большой теоретический, методический и экспериментальный опыт в разработке оригинальных высокоэффективных гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток различных микроорганизмов (бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов). Успешность этих разработок отражена в 15 патентах РФ на изобретения, полученных за последние 8 лет исследований, что подтверждает также новизну разработанных способов получения новых иммобилизованных биокатализаторов и самих биокатализаторов, обладающих высокими каталитическими характеристиками, существенно превышающими известные аналоги. Научный подход, лежащий в основе этих разработок, заключается в использовании методов иммобилизации и научно-обоснованном выборе условий проведения процесса, максимально сохраняющих жизнеспособность и метаболическую активность клеток. Для выяснения таких условий используется анализ физиологического состояния клеток с помощью микробиологических и биохимических методов анализа, а также с использованием биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ люциферин-люциферазным методом, позволяющим оценить общий энергетический статус клеток и сделать вывод об их метаболической активности и, следовательно, эффективности действия иммобилизованных клеточнцых популяций. Такой подход обеспечивает получение иммобилизованных биокатализаторов с высокой операционной стабильностью, то есть длительным периодом полуинактивации в каталитическом процессе, направленном на получение целевого продукта.

1. Разработана серия вариантов высококонцентрированных популяций клеток в свободном и иммобилизованном виде продуцирующих разные высокомолекулярные полисахариды (декстран, пуллулан, бактериальную целлюлозу). 2. Исследованы свойства разработанных биокаталитических систем в модельных средах, содержащих разные моно- и дисахариды. 3. Осуществлена подготовка субстратов для их биотрансформации в высокомолекулярные полисахариды с использованием разработанных оригинальных биокаталитических систем. 4. Исследован процесс накопления иммобилизованными клетками разных продуцентов соответствующих им полисахаридов в средах с разными физико-химическими характеристиками. 5. Определены биокаталитические характеристики иммобилизованных клеток, стабильность каталитического действия, физико-химические условия проведения трансформации. 6. Исследованы свойства иммобилизованных клеток в составе высококонцентрированных популяций с теми, что характерны для тех же клеток, но при проведении процессов в аналогичных условиях с использованием клеток в свободном от носителя (суспензионном) виде.