ИСТИНА

В последние годы, благодаря развитию эффективных химиотерапевтических подходов, продолжительность жизни пациентов с онкологическими заболеваниями заметно возросла. С другой стороны, увеличение продолжительности жизни нередко позволяет проявиться отдаленным побочным эффектам химиотерапии, пройденной пациентом. К числу таких последствий относятся так называемые вторичные, или обусловленные лечением/индуцированные терапией (treatment-related) лейкозы. Чаще всего вторичные лейкозы развиваются после применения препаратов из класса ингибиторов ДНК-топоизомераз II типа – ключевых ферментов, регулирующих топологию ДНК. В ходе генетического анализа пациентов с вторичными лейкозами нередко обнаруживаются хромосомные транслокации с участием генов AML1(RUNX1) и MLL(KMT2A). Данные гены регулируют нормальное развитие клеток крови, и транслокации с их участием приводят к опухолевой трансформации кроветворных клеток. Считается, что хромосомные транслокации возникают вследствие ошибочной репарации двухцепочечных разрывов ДНК, которые случаются при ингибировании ДНК топоизомераз II типа. Тем не менее, детали молекулярных процессов, сопровождающих формирование хромосомных транслокаций, в значительной степени неизвестны. Так, для возникновения перестройки концы разрывов ДНК должны физически встретиться в пространстве ядра. Однако расположение хромосом в ядре в виде обособленных территорий должно накладывать заметные ограничения на случайное соединение поврежденных концов разных хромосом. Существующие клеточные модели лейкозов позволяют изучать, как наличие той или иной хромосомной транслокации влияет на функционирование клетки. Но такие модели не воспроизводят ранние события, приводящие к образованию самой транслокации. А поскольку гены-партнеры по транслокациям локализованы на разных хромосомах — именно пространственная мобильность данных локусов в ядре играет решающую роль в формировании лейкозогенных перестроек. Для изучения механизмов, обеспечивающих внутриядерную подвижность генов-партнеров по транслокациям, ассоциированным с развитием вторичных лейкозов, а также для поиска способов снижения риска их возникновения, мы планируем создать клеточные модели, в которых можно будет исследовать процесс формирования транслокаций «в реальном времени». В ходе выполнения проекта на основе лимфобластоидной культуры RPMI-8866 будет получена и охарактеризована панель стабильных клеточных линий, несущих в себе элементы системы CRISPR/Cas9, экспрессия которых находится под контролем индуцируемого промотора. Это позволит вносить двуцепочечные разрывы в ДНК в строго определенных местах генома. С использованием различных направляющих РНК (гидРНК) планируется индуцировать разрывы в ДНК таких частых генов-партнеров по хромосомным транслокациям как AML1, ETO, MLL и AF9, и проанализировать пространственную мобильность этих поврежденных локусов, интегрировав в целевые локусы элементы системы ANCHOR. В этой системе белок, называемый OR, будет слит с флуоресцентным репортером. Белок OR способен олигомеризоваться на специфической последовательности, называемой ANCH, интегрированной в целевой локус. Используя эту систему, мы получим возможность наблюдать за динамикой разорванных локусов ДНК в живой клетке «в реальном времени». Получение таких клеточных моделей позволит провести ингибиторный анализ и определить вероятные механизмы, ответственные за релокализацию исследуемых генов в пространстве ядра, а также протестировать различные соединения (потенциальные терапевтические агенты) на предмет снижения частоты возникновения лейкозогенных хромосомных транслокаций. В дальнейшем, эти модели могут быть также использованы для исследования процессов репарации двуцепочечных разрывов ДНК в клетках человека.

Recent years, with the development of effective chemotherapeutic approaches, the life expectancy of patients with cancer has increased markedly. On the other hand, an increase in life expectancy allows long-term side effects of the patient's chemotherapy to be manifested. Such consequences include so-called “secondary” or “treatment-related” leukemia. Most often secondary leukemia develops after the use of drugs from the class of inhibitors of DNA topoisomerases type II - key enzymes that regulate the DNA topology. In the genetic analysis of patients with secondary leukemia chromosomal translocations with AML1 and MLL genes are often found. These genes regulate the normal development of blood cells, so the violation of their regulation leads to a tumor transformation of the hematopoietic cells. It is believed that chromosomal translocations arise from the erroneous repair of double-stranded DNA breaks introduced by topoisomerase II upon its inhibition. Nevertheless, the details of the molecular processes that accompany the formation of chromosomal translocations are largely unknown. Thus, for the onset of translocation, the ends of the DNA breaks should meet each other inside the nucleus. However, the arrangement of chromosomes in the nucleus in the form of isolated territories should impose appreciable restrictions on the random connection of damaged ends of different chromosomes. Existing cellular models of leukemia allow one to study how the presence of a particular chromosomal translocation affects the functioning of the cell. But such models do not reproduce the early events that lead to the formation of a proper translocation. And since the most well known translocation partner genes are localized on different chromosomes, it is spatial mobility of these loci in the nucleus that plays a decisive role in the formation of leukemogenic rearrangements. To study the mechanisms that provide the intranuclear mobility of known partner genes for chromosomal translocations associated with the development of secondary leukemias, and in order to find ways to reduce the risk of their occurrence, we plan to obtain cellular models in which it will be possible to study the formation of translocations "in real time". In the course of the current project, based on the lymphoblastoid culture of RPMI-8866, a panel of stable cell lines carrying CRISPR/Cas9 elements, whose expression is under the control of an inducible promoter, allowing inducing double strand breaks in DNA at strictly defined sites of the genome, will be obtained and characterized. Using different guide RNAs, we will induce the DNA breaks of such frequent genes-partners on chromosomal translocations as AML1, ETO, MLL and AF9, and analyze the spatial mobility of their damaged loci. By integrating the elements of the ANCHOR system (where the OR protein will be fused with the fluorescent reporter and will oligomerize on the sequences at the target locus), we will obtain cell lines that allow studying the dynamics of the broken DNA loci in a living cell "in real time". The preparation of such cell models will allow to conduct inhibitory analysis and to determine the probable mechanisms responsible for relocalization of the genes-partners in the nucleus, and also to test various compounds for decreasing the incidence of leukemogenic chromosomal translocations. Further, these models can also be used to study the repair mechanisms of double-stranded DNA breaks in human cells.

В результате выполнения проекта нами будут получены и охарактеризованы клеточные линии, стабильно несущие в геноме элементы индуцируемой системы CRISPR/Cas9, позволяющие «в реальном времени» исследовать процесс формирования хромосомных транслокаций, ассоциированным с вторичными лейкозами: AML1-ETO и MLL-AF9. Будет проанализирована пространственная мобильность в ядре, расположение относительно хромосомных территорий, а также взаимное пространственное расположение в концов разрывов ДНК и интактных аллелей данных генов-партнеров. Анализ с применением широкого спектра специфических ингибиторов, имеющихся в нашей лаборатории, белковых факторов и метаболических путей позволит определить молекулярные механизмы, обеспечивающие внутриядерную подвижность генов-партнеров и предположить либо опровергнуть наличие некоего специального и, возможно, универсального механизма движения и/или репарации, обуславливающего возникновение лейкозогенных хромосомных транслокаций. Наличие такой модели, несомненно, вызовет огромный интерес со стороны специалистов в данной области. Выполнение заявленного проекта приведет к получению оригинальных приоритетных результатов, которые не имеют аналогов в литературе, и будут соответствовать мировому уровню исследований в данной области. В результате выполнения проекта будут получены новые фундаментальные знания о механизмах возникновения транслокаций, которые смогут быть применены при разработке новых подходов к химиотерапии опухолей, снижающих вероятность возникновения вторичных лейкозов. Результаты проекта будут представлены на международных конференциях и опубликованы в рецензируемых научных изданиях.