![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Губки (Porifera) являются одной из древнейших групп ныне живущих многоклеточных животных. Губки имеют необычный для многоклеточных животных план строения, а их ткани и анатомические структуры крайне пластичны. В связи с этим изучение механизмов функционирования тканей и поведения клеток у губок важны для понимания общих принципов устройства тканей многоклеточных животных и реконструкции путей возникновения многоклеточности. Данный проект посвящен исследованию клеточных и молекулярных механизмов реагрегации клеток и восстановления исходной организации губок. В рамках проекта будут впервые описаны интенсивность и роль пролиферации и апоптоза, проанализирован паттерн экспрессии основных генов сигнальных путей Wnt и TGF-beta и проведен функциональный анализ роли этих сигнальных путей в реагрегации клеток и последующем развитии многоклеточных агрегатов губок. В качестве объектов исследования будут использованы губки из двух классов (Demospongiae и Calcarea), значительно различающихся по своему филогенетическому положении и анатомическому строению, что позволит провести сравнительный анализ полученных результатов. Полученные данные углубят имеющиеся знания о механизмах функционирования тканей губок и восстановительных процессах у этих древних животных, без чего невозможен дальнейший прогресс в понимании возникновения и эволюции тканей многоклеточных животных.
Sponges (Porifera) are one of the most ancient extant multicellular animals. Sponges have very unusual body plan and are characterized by high plasticity of tissues and anatomical structures. Concerning these peculiarities, the study of tissue functioning and cellular behavior in sponges are important for unrevealing the general principals of tissue functioning in multicellular animals and reconstruction of the origin of multicellularity. The current project is devoted to study of cellular and molecular mechanisms of cell reaggregation and reconstruction of intact body in sponges. For the first time for sponge cell reaggregation and subsequent development of multicellular aggregates the intensity and role of cell proliferation and apoptosis will be described and expression and functional analysis of Wnt and TGF-beta signaling pathways will be performed. The sponges from two classes (Demospongiae and Calcarea), significantly differing in their phylogenetic position and anatomical structure, will be used as model objects. It will allow making a comparative analysis of the obtained results. The obtained data will elaborate the existing knowledge about the mechanisms of tissue functioning and regenerative processes in sponges, without which further progress in understanding of the origin and evolution of tissues of multicellular animals is impossible.
В результате реализации проект будут получены оригинальные фундаментальные данные о клеточных (пролиферация, апоптоз, способность к де- и трансдифференцировкам, миграции и изменения формы) и молекулярных (участие генов сигнальных путей Wnt и TGF-beta) механизмах реагрегации клеток губок. Использование в качестве модельных объектов губок из классов Demospongiae и Calcarea, значительно различающихся по своему филогенетическому положении и анатомическому строению, позволит провести сравнительный анализ полученных данных как внутри губок, так и с Eumetazoa. Подобный анализ необходим для последующего прогресса в понимании возникновения и эволюции тканевой организации и восстановительных процессов многоклеточных животных. Кроме того, в рамках проекта будет получен ряд принципиально новых конкретных данных: 1) впервые будет проанализировано влияние количества клеток в многоклеточных агрегатах на их развитие и морфогенетические потенции; 2) впервые будут описаны интенсивность и роль пролиферации и апоптоза в реагрегации клеток и последующем развитии многоклеточных агрегатов губок; 3) впервые будет проанализирован паттерн экспрессии лигандов сигнальных путей Wnt и TGF-beta, в ходе реагрегации клеток губок, а также оценена активность этих сигнальных путей на уровне эффекторов; 4) впервые будет проведен функциональный (ингибиторный) анализ роли канонического сигнального пути Wnt в процессе реагрегации клеток и восстановления исходной организации губки; 5) впервые будет изучен процесс восстановления исходной организации губки после диссоциации клеток у Leucosolenia variabilis, описаны морфогенезы и поведение клеток, лежащие в основе этого процесса. Помимо фундаментальной ценности, полученные данные и их сравнительный анализ может иметь значение для исследований регенерации у человека и развития регеративной медицины. Будут получены данные по участию двух сигнальных систем в развитии конгломератов соматических клеток низших многоклеточных, ценные для восстановления картины эволюции механизмов межклеточной коммуникации. Практическое значение могут иметь и данные по динамики реагрегации клеток и влияния факторов внешней среды на этот процесс, так как могут быть использованы для разработки методик долговременного культивирования многоклеточных агрегатов губок с целью выделения из них биологически активных веществ.
Все участники коллектива имеют обширный опыт работы с губками и культурами их клеток и многоклеточных агрегатов; владеют методами работы на трансмиссионном и сканирующем электронном микроскопе, а также на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе; владеют широким спектром методик фиксации и последующей обработки материала для гистологических, ультраструктурных, иммуногистохимических исследований. Борисенко И.Е. владеет молекулярно-биологическими методами изучения экспрессии генов, такими как анализ транскриптомных данных in silico, ПЦР, молекулярное клонирование, гибридизация РНК in situ, а также методами изучения активности сигнальных путей. К настоящему моменту коллективом отработаны методы получения суспензий клеток губок, методы долговременного культивирования суспензий клеток. Проведена оценка влияние некоторых факторов на процесс реагрегации клеток у Halisarca dujardinii . Описаны основные стадии и динамика процесса реагрегации клеток и восстановления исходной организации у H. dujardinii и L. variabilis; выделены критические стадии процесса реагрегации. Проведены детальные исследования строения многоклеточных агрегатов и выделены морфогенезы, участвующие в процессе реагрегации клеток и восстановления исходной организации, и прослежена судьба основных клеточных типов. Отработаны методики выявления пролиферирующих клеток у H. dujardinii и L. variabilis. Были проведены предварительные исследования пролиферации клеток в ходе реагрегации и восстановления исходной организации H. dujardinii, которые позволили адаптировать методы окраски для многоклеточных агрегатов и качественно описать пролиферацию клеток на разных этапах процесса. В распоряжении коллектива имеется аннотированный транскриптом H. dujardinii. Отработана методика гибридизации in situ на взрослых губках, зародышах и личинках. В транскриптоме идентифицированы и клонированы гены-участники сигнального пути Wnt и описаны их паттерны экспрессии на взрослых губках.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Клеточные и молекулярные механизмы реагрегации клеток и восстановления исходной организации у губок из классов Demospongiae и Calcarea |
Результаты этапа: В качестве объекта исследования были использованы демоспонгия Halisarca dujardinii и известковая губка Leucosolenia cf. variabilis. Сбор образцов проводили в Кандалакшском заливе Белого моря в окрестностях Беломорской биологической станции им. Н.А. Перцова (66°34′ N, 33°08′ E). Образцы собирали в верхней сублиторали во время отлива. До начала экспериментов губок содержали в аквариумах с проточной морской водой или в лабораторном аквариуме (100 л, естественная морская вода, биологический фильтр, температура 6-12°C, ежедневная смена 50% воды) не более 5 суток. Эксперименты начинали не ранее, чем через 24 часа после сбора губок. Leucosolenia cf. variabilis 1) Реагрегации клеток Leucosolenia variabilis В наших предыдущих исследованиях мы показали, что в результате реагрегация клетки Leucosolenia cf. variabilis способны через 24 часа после диссоциации (чпд) формировать первичные многоклеточные агрегаты – мелкие неэпителизированные скопления клеток без какой-либо четкой внутренней структуры (Рис. 1А). Первичные агрегаты в свою очередь преобразуются в ранние примморфы к 5-7 суткам после диссоциации (спд), когда на их поверхности начинается процесс эпителизации (Рис. 1Б). Однако ранее мы не наблюдали процесс полной эпителизации ранних примморфов, и эти агрегаты без какого-либо дальнейшего развития сохраняли свою жизнеспособность вплоть до 25 спд, после чего погибали в культурах. В рамках настоящего проекта при работе с реагрегацией клеток Leucosolenia cf. variabilis мы сосредоточились на индукции дальнейшего прогрессивного развития ранних примморфов. Для этого применяли разные методы диссоциации тканей для получения суспензий клеток (механический и химический), исследовали влияние культуры клеток следующих параметров: концентрации клеток в суспензии, время культивации на орбитальном шейкере, температура культивации, а также культивация агрегатов в лабораторном аквариуме с естественной морской водой (100 л, естественная морская вода, биологический фильтр, температура 6-12°C, ежедневная смена 50% воды). В ходе этих исследований были получены культуры клеток от 40 особей Leucosolenia cf. variabilis. Перед началом диссоциации губок тщательно очищали от детрита и эпибионтов, несколько раз промывали стерильной морской водой (морская вода, профильтрованная через фильтр 0,22 мкм) (СМВ). Для диссоциации тканей было использовано два метода – механический и химический. Механическая диссоциация. Ткани губок измельчали с помощью пинцета и скальпеля в СВМ, а затем протирали сквозь мельничный газ с размером ячеи 50 мкм в емкость с СМВ. Химическая диссоциация. Ткани губок измельчали с помощью пинцета и скальпеля и помещали в безкальциевую и безмагниевую искусственную морскую воду (0.3M NaCl, 20mM KCL, 15mM EDTA, 10mM Tris-HCl) (БКМВ), изотоничную беломорской воде. Затем кусочки тканей инкубировали БКМВ в течении 60 мин при постоянном перемешивании на орбитальном шейкере. Через 60 мин полученную суспензию клеток переливали в центрифужную пробирку (для удаления оставшихся кусочков тканей, крупных клеточных агрегатов и спикул применяли фильтрование через мельничный газ с размером ячеи 50 мкм) и проводили отмывку клеток от БКМВ, которая препятствует реагрегации клеток. Для этого суспензии центрифугировали 10 минут при 800 g, сливали супернатант и ресуспендировали клетки в СВМ, помещали на орбитальным шейкер при 70 об/мин. Каждые 30 минут проводили смену СВМ – центрифугировали суспензии 3 минуты при 800g, а затем ресуспендировали в свежей порции СВМ. Всего проводили по три смены СВМ для каждой суспензии. Для предотвращения нагревания образцов во время центрифугирования ротор центрифуги предварительно охлаждали. Из полученных суспензий клеток отбирали аликвоты (10 мкл) для определения концентрации клеток с помощью камеры Горяева. Затем суспензии клеток разливали в чистые пластиковые чашки Петри диаметром 30 мм. В каждую чашку помещали 5 мл суспензии. Из каждой особи получали 2-5 чашки Петри с суспензией клеток. Для интенсификации процесса реагрегации культуры клеток помещали на орбитальный шейкер при скорости вращения 70 об/мин. Каждые 48 часов производили замену половины культуральной среды на свежую СВМ. Каждые 24 часа на протяжении всего времени культивирования проводили визуальное обследование чашек Петри и делали фотографии многоклеточных агрегатов с помощью стереомикроскопа Leica M165FC (Leica) оборудованного цифровой камерой Leica DFC 420 (Leica) и программным обеспечением Leica LAS Store and Recall v.4.2 (Leica). Жизнеспособность агрегатов определялась по их внешнему виду: нежизнеспособные агрегаты быстро теряли характерную форму, их поверхность становилась очень неровной. Эти процессы сопровождались активным выходом из состава агрегатов отдельных клеток. Гибель агрегатов сопровождалась их полной диссоциацией. Для изучения влияния концентрации клеток на процесс реагрегации суспензия клеток, полученная от одной особи, разводилась с помощью СВМ до концентраций n x 10^5 – n x 10^5. Этот эксперимент был проведен на суспензиях клеток 5 особей. Для изучения влияния температуры культивации на процесс реагрегации суспензии клеток одинаковой концентрации культивировали при температурах 2-4°С, 10-12°С и 15-16,5°С. Этот эксперимент был проведен на суспензиях клеток 5 особей. Для изучения влияния времени содержания суспензий на орбитальном шейкере на процесс реагрегации суспензии клеток одинаковой концентрации культивировали на шейкере 1, 5, 12 и 24 ч при температуре 10-12°С. Этот эксперимент был проведен на суспензиях клеток 5 особей. Для исследования влияния переноса агрегатов в лабораторный аквариум использовали агрегаты возрастом 4 спд и 20 спд. Жизнеспособные культуры удалось получить только при использовании механического метода диссоциации тканей. В культурах, полученных в результате химической диссоциации, агрегаты либо не формировались, либо были настолько малочисленными и хрупкими, что погибали в течение 1-2 часов. Исследования влияния температуры культивации на процесс реагрегации клеток показали, что оптимальной температурой является 10-12С. При 15-16,5С развитие агрегатов в культурах происходит с той же скоростью, что и при 10-12С, однако повышается шанс появления бактерий и грибов, контаминирующих культуру и приводящих к ее гибели. При температуре 2-4С развитие агрегатов сильно замедляется. Исследования влияния концентрации клеток на процесс реагрегации показали, что в культурах с наименьшей концентрацией клеток (n x 10^5 кл/мл) происходило формирование первичных многоклеточных агрегатов, но они погибали в течение следующих 2-4 суток. В культурах с концентрацией порядка n x 10^6 кл/мл реагрегация также происходила, количество агрегатов было значительно больше, и они сливались друг с другом, образуя более крупные агрегаты. Наилучшие результаты были достигнуты при концентрациях n x 10^7 кл/мл. В таких культурах наблюдалось формирование большого числа относительно крупных агрегатов и примморфов, которые могли долго сохранять жизнеспособность. При культивации на шейкере в течение 1 часа культуры оказывались нежизнеспособными, агрегаты быстро прилипали ко дну чашек Петри и постепенно разрушались к 2 спд. При культивации 5 и 12 часов в культурах наблюдалось образование первичных многоклеточных агрегатов, которые имели размер до 100 мкм, однако и такие агрегаты сохраняли жизнеспособность в течение только 2-4 дней. При 24 часах культивации были получены крупные (более 100 мкм) и долгоживущие многоклеточные агрегаты. Для основных экспериментов мы использовали суспензии клеток, полученные механическим методом диссоциации тканей, с концентрацией клеток n x 10^6-10^7 кл/мл, культивировавшиеся при температуре 10-12С. Первые 24 часа культуры содержали на орбитальном шейкере при 70 об/мин. При использовании такой комбинации экспериментальных процедур и условия последующей культивации нам удалось долгоживущие (до 25 спд) культуры агрегатов Leucosolenia cf. variabilis, в которых происходило прогрессивное развитие ранних примморфов этого вида. Тем не менее, полного восстановления исходной организации губки в культурах мы не наблюдали. К прогрессивному развитию были способны лишь ранние примморфы размер, которых был больше 500 мкм. Часть развивающих примморфов может прикрепляться к субстрату (Рис. 1Г), но сроки прикрепления сильно варьируются от культуры к культуре (6-12 спд). К 15 спд поверхность этих агрегатов при прижизненных наблюдениях выглядела гладкой, что, по нашему мнению, соответствует моменту формированию сплошной экзопинакодермы и преобразованию ранних примморфов в настоящие (Рис. 1В). После эпителизации во внутренних частях примморфов появляется заметная неоднородность из более темных и более светлых участков, что, вероятно, соответствует началу формирования первых полостей водоносной системы. Кроме того, уже на 10 спд в составе ранних примморфов начинается процесс восстановления скелета –появляются первые спикулы–триактины, которые постепенно увеличиваются в размерах (Рис 1Д). Тем не менее, число новых спикул остается невысоким, они не формируют сплошной и правильно организованной сети. Кроме того, мы не наблюдали формирования новых диактин. Таким образом, настоящие примморфы с первыми полостями водоносной системы и новообразованными триактинами были последней стадией реагрегации клеток Leucosolenia cf. variabilis. Дальнейшего их развития в культурах не происходило, но они могли сохранять жизнеспособность вплоть до 25 спд после чего разрушались. 2) Фиксация материала для гистологического, ультраструктурного и иммуногистохимического исследования морфогенетических процессов при прогрессивном развитии многоклеточных агрегатов Leucosolenia cf. variabilis Для проведения гистологических, ультраструктурных и иммуногистохимических исследований многоклеточные агрегаты из долгоживущих культур агрегатов Leucosolenia cf. variabilis фиксировали каждые 48 часов на протяжении всего времени жизни культур. В каждой временной точке фиксировали несколько агрегатов из культур, полученных от разных особей. Для гистологических и ультраструктурных исследований агрегаты фиксировали 2,5% глутарового альдегида на фосфатном буфере Миллонига (Millonig, 1964) или 0,1М модифицированном натрий-какодилатном буфере с постфиксацией 1% тетроксидом осмия на том же буфере. Оба буфера изотоничны местной морской воде. Дополнительные исследования на интактных тканях губки показали, что тип буфера не оказывал заметного влияния на структуру клеток. После фиксации образцы отмывали, растворяли в них спикулы с помощью 5% раствора ЭДТА, обезвоживали и заключали в эпоксидную смолу Epon/Araldite (в соответствии с инструкцией производителя) (такие образцы будут использованы для получения полутонких и ультратонких срезов) или высушивали в критической точке в атмосфере CO2 (такие образцы будут использованы для исследований с помощью сканирующего электронного микроскопа). Для иммуногистохимических исследований агрегаты фиксировали 4% PFA на PBS и хранили в фиксаторе до дальнейших исследований. Всего было зафиксировано около 200 агрегатов для гистологических и ультраструктурных исследований и 250 агрегатов для иммуногистохимических исследований. 3) Провести иммуногистохимическое исследование поведения хоаноцитов в ходе реагрегации клеток Leucosolenia cf. variabilis Для проведения иммуногистохимических исследований агрегаты, зафиксированные 4% PFA на PBS, трижды отмывали в PBS, пермобилизовывали 0,5% раствором Triton X-100 на PBS мин, трижды отмывали в блокирующем растворе (1% BSA, 0,1% cold‐water fish skin gelatin, 0,5% Triton X‐100, 0,05% Tween‐20 на 0,01M PBS), и инкубировали в растворе первичных антител против ацетилированного-альфа-тубулина (T6793, Sigma-Aldrich) на блокирующем растворе (разведение 1:1000) в течение 8-12 ч при 4°С. От первичных антител образцы трижды отмывали блокирующим растворов, а затем инкубировали в свежей порции блокирующего раствора в течение 8-12 ч при 4°С. После инкубации в блокирующем растворе образцы помещали в раствор вторичных антител Donkey Anti-Mouse IgG Alexa 488 (A21202, Thermo Fisher Scientific) на блокирующем растворе (разведение 1:2000) в течение 8-12 ч при 4°С. После инкубации во вторичных антителах образцы трижды отмывали PBS и проводили окрашивание ядер с помощью 2 мкг/мл раствора DAPI на PBS в течение 30 мин. После окрашивания ядер образцы трижды отмывали в 0,01M PBS и заключали в 90% глицерин с 2,5% DABCO на M PBS. Полученные препараты изучали на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Nikon A1 (Nikon). С каждого препарата получали один или несколько Z-стэков толщиной 20-100 мкм с шагом 1 мкм. Полученные Z-стэки изучали с помощью программ NIS Viewer v.4.5 и FiJi ImageJ v.1.52i. Применение антител против ацетилированного-альфа-тубулина позволило нам выявить жгутики хоаноцитов и использовать их как маркер этого типа клеток. В первичных многоклеточных агрегатах (1-3 спд) встречается большое количество хоаноцитов, несущих жгутики (Рис. 2А). Хоаноциты располагаются как на поверхности агрегатов, так и в их внутренних частях. Нередко хоаноциты образуют плотный группы, что, вероятно, является результатом попадания в состав агрегата не до конца диссоциированного фрагмента хоанодермы интактной губки. В ходе преобразования первичных агрегатов в ранние примморфы количество хоаноцитов сокращается – встречаются лишь несколько клеток в составе агрегата (Рис. 2Б). При дальнейшем развитии ранних примморфов и формировании настоящих примморфов (10-15 спд) происходит почти полное исчезновение хоаноцитов – большинство настоящих примморфов вообще не имеет в своем составе хоаноцитов, некоторые несут единичные клетки (Рис. 2В). Такое поведение хоаноцитов в составе многоклеточных агрегатов Leucosolenia cf. variabilis, вероятно, можно объяснить процессом постепенной дедифференцировки (и, возможно, трансдифференцировки) хоаноцитов, которые в ходе этого процесса теряют жгутик. Этот паттерн поведения хоаноцитов сходен с тем, что мы ранее показали для губок из класса Demospongiae, на примере Halisarca dujardinii. Так, у H. dujardinii хоаноциты со жгутиками встречаются в большом количестве в первичных агрегатах возрастом до 24 чпд и полностью исчезают из состава настоящих примморфов к 1-3 спд, дедифференцируясь и пополняя гетерогенный пул амебоцитов. Тем не менее, у Leucosolenia cf. variabilis этот процесс (как и развитие многоклеточных агрегатов, в целом) происходит гораздо медленнее, чем у H. dujardinii. Дальнейшую судьбу дедифференцировавшихся хоаноцитов Leucosolenia cf. variabilis мы надеемся прояснить при ультраструктурных исследованиях агрегатов. Halisarca dujardinii Для всех экспериментов суспензий клеток H. dujardinii получали механическим методом диссоциации тканей, так как он позволяет быстро получать жизнеспособные суспензии с высокой концентрацией клеток (Lavrov et al., 2016). Из полученных суспензий клеток отбирали аликвоты (10 мкл) для определения концентрации клеток с помощью камеры Горяева. Получаемые суспензии клеток имели концентрации 1-3×10^7 кл/мл. Суспензии клеток разливали в чистые пластиковые чашки Петри диаметром 30 мм. В каждую чашку помещали 5 мл суспензии. Из каждой особи получали 2-5 чашки Петри с суспензией клеток. Культуры клеток содержали в СВМ при температуре 10-12°С. Каждые 48 часов производили замену половины культуральной среды на свежую СВМ. Каждые 24 часа на протяжении всего времени культивирования проводили визуальное обследование чашек Петри. На основании предыдущих исследований (Lavrov et al., 2016) мы выделяли следующие стадии развития многоклеточных агрегатов: первичные агрегаты, ранние примморфы, настоящие примморфы, развитие водоносный системы (раннее), развитие водоносный системы (позднее), появление зачатков оскулюмов, восстановившаяся губка. Достижение агрегатами той или иной стадии развития определялось путем визуального наблюдения культур под стереомикроскопом по характерным для конкретной стадии морфологическим признакам. Тем не менее, учитывая асинхронность развития агрегатов даже в пределах одной культуры, при любых фиксациях в пробу попадал гетерогенный набор агрегатов, немного отличающихся стадией развития. Жизнеспособность агрегатов также определялась по их внешнему виду. 4) Подбор методики получения агрегатов Halisarca dujardinii, состоящих из определенного числа клеток Для получения агрегатов, состоящих из определенного числа клеток, мы разводили суспензии клеток с помощью СМВ до определенных концентраций так, чтобы в объеме суспензии, используемом для получения агрегата, содержалось необходимое количество клеток. В ходе этих экспериментов мы тестировали несколько метод получения агрегатов. В каждом случае в качестве контроля ставили обычную культуру клеток (5 мл суспензии в 30-мм пластиковой чашке Петри). Метод висячей капли. Капли суспензии разной концентрации наносились на крышку 90-мм пластиковой чашки Петри, затем крышка переворачивалась над чашкой, заполненной СВМ. Культивацию проводили при температуре 8-12С. Через 24 часа проверяли состояние культур. Было проведено 3 эксперимента, отличающихся условиями: - эксперимент 1. Объем капли 50 мкл; ожидаемое количество клеток в агрегатах 100 (2x10^3 кл/мл), 500 (1x10^4 кл/мл), 1000 (2x10^4 кл/мл), 5000 (1x10^5 кл/мл), 10000 (2x10^5 кл/мл). - эксперимент 2. Объем капли 25 мкл; ожидаемое количество клеток в агрегатах 10000 (4x10^5 кл/мл), 50000 (2x10^6 кл/мл), 100000 (4x10^6 кл/мл), 217500 (8,7x10^6 кл/мл) (Рис. 3). - эксперимент 3. Объем капли 25 мкл; ожидаемое количество клеток в агрегатах 150000 (6x10^6 кл/мл). При культивировании клеток млекопитающих культуры висячей капли позволяют получать единый агрегат из всех клеток, содержащихся в капли, за счет низкой адгезивности поверхностной пленки воды для клеток млекопитающих. Однако эксперимент 1 показал, что клетки H. dujardinii способны закрепляться на поверхностной пленке. Это приводило к формированию множества мелких агрегатов, прикрепленных к поверхностной пленке капли. Кроме того, по количеству и размеру агрегатов стало ясно, что минимальное количество клеток на агрегат должно быть более 10000, так как при меньшем количестве клеток можно ожидать лишь формирования крайне мелких агрегатов, с которыми будет невозможно проводить полноценные эксперименты и наблюдения. Эксперимент 2 (уменьшение объема капли и увеличение количества клеток) показал, что увеличение концентрации клеток в капле приводит к формированию множества более крупных агрегатов, но не формированию единого агрегата (Рис. 3 А-Г). В ходе эксперимента 3 мы пытались забрать все агрегаты из одной капли и собрать их в единый агрегат за счет последующего центрифугирования. Но большинство агрегатов имело сильный контакт с поверхностной пленкой и их не удавалось от нее отделить и перенести в микроцентрифужную пробирку. Кроме того, в рамках эксперимента 2 мы попробовали культуры «лежачей капли», когда крышка с каплями не переворачивается – мы надеялись, что под действием гравитации клетки буду оседать на пластиковое дно и не будут прилипать к поверхностной пленке (наши предыдущие опыты с обычными культурами клеток H. dujardinii показывают, что клетки не образуют контакта с пластиком чашек Петри, а агрегаты в большинстве случаев развиваются в неприкрепленном состоянии). Однако и в таких культурах большинство клеток формировало мелкие агрегаты на поверхностной пленке капель (Рис. 3Д-З). Реагрегация в капиллярах. В ходе этого эксперимента капли суспензии определенной концентрации засасывались внутрь стеклянного капилляра, диаметром 2 мм. Капилляры ставили вертикально на парафильм. Ожидаемое количество клеток в агрегатах 150000 (6x10^6 кл/мл). Культивацию проводили при температуре 8-12С. Через 24 часа проверяли состояние культур. В этом эксперименте также формировалось множество мелких агрегатов, которые оказались плотно прикреплены к стенкам капилляром. Забрать агрегаты из капилляров для последующего центрифугирования также не удалось. Реагрегация в пластиковых иммунологических планшетах. В ходе этого эксперимента капли суспензии определенной концентрации наносили на лунки иммунологического планшета. Объем капли 25 мкл; ожидаемое количество клеток в агрегатах 10000 (4x10^5 кл/мл), 50000 (2x10^6 кл/мл), 100000 (4x10^6 кл/мл), 125000 (5x10^6 кл/мл), 425000 (1,7x10^7 кл/мл). Также как и в предыдущих экспериментах в каждой капле сформировалось множество мелких агрегатов, которые оказались плотно прикреплены к стенкам лунок. Центрифугирование суспензий. Капли (50 мкл) суспензии (концентрация клеток 5x10^6 кл/мл) помещали в ПЦР-пробирки и центрифугировали в центрифуге с бакет-ротором при 750g в течении 15 мин. Было проведено 2 эксперимента. - эксперимент 1. Центрифугирование сразу после получения суспензии. - эксперимент 2. Центрифугирование через 1 час после получения суспензии. Центрифугировании сразу после получения суспензии (эксперимент 1) приводило к оседанию всех клеток на дно пробирок. Но эти клетки формировали не агрегат, а тонкий слой на дне пробирок. В последствии такие клетки формировали мелкие агрегаты, прикрепленные к дну пробирок. В эксперименте 2 суспензии сразу после получения помещали в ПЦР-пробирки и оставляли в них на 1 час при 8-12С. Через час в каждой пробирке формировалось множество мелких первичных агрегатов. Последующее центрифугирование осаждало все агрегаты на дно пробирок, вследствие чего эти агрегаты вступали в контакт друг с другом. После центрифугирования пробирки с агрегатами культивировали еще 24 часа при 8-12С. На следующей день в результате слияния первичных агрегатов в каждой пробирки формировался единый агрегат. Таким образом, в результате серии экспериментов нами был впервые отработан метод получения агрегатов H. dujardinii, состоящих из определенного числа клеток, и были получены первые агрегаты, состоящие из 250000 клеток. Эти агрегаты удалось извлечь из пробирок и провести хи дальнейшую культивацию в 24-лучночных пластиковых планшетах в СВМ. Все агрегаты сохраняли жизнеспособность в течение 10 суток (эксперимент был завершен на 10 сутки) и их развитие не отличалось от развития агрегатов из контрольных культур. Необходимость отработки методики замедлила выполнения задачи по исследованию влияния количества клеток в многоклеточных агрегатах H. dujardinii на их развитие и морфогенетические потенции. Основные эксперименты по этой задаче будут перенесены на следующий год. 5) Фиксация материала для гибридизации нуклеиновых кислот in situ, а также для исследования пролиферации и апоптоза клеток в ходе реагрегации клеток и восстановления исходной организации H. dujardinii Фиксация для гибридизации нуклеиновых кислот in situ Фиксацию проводили 3 фиксаторами: 1) MEMFA (0,1M MOPS, 2mM EGTA, 4% PFA), 2) MEMFA NaCl (0,1M MOPS, 2mM EGTA, 0,5mM NaCl, 4% PFA), 3) MOPS-PFA-GA (0,1M MOPS, 4% PFA, 0,05% глутаровый альдегид). Были зафиксированы многоклеточные агрегаты на следующих стадиях развития: первичные агрегаты 3 чпд, первичные агрегаты 12 чпд, ранние примморфы/настоящие примморфы 24 чпд, настоящие примморфы 3 спд, развитие водоносной системы (раннее)*, развитие водоносной системы (позднее)*, появление зачатков оскулюмов*, восстановившаяся губка*. На каждой стадии фиксировалось несколько десятков агрегатов, полученных как минимум от трех особей. Время наступления стадий отмеченных (*) варьирует в культурах, полученных от разных особей, в силу асинхронного развития агрегатов. После фиксации агрегаты были переведены в 70% этиловый спирт и хранились в нем при температуре -20С. Исследования пролиферации клеток Для выявления клеток, синтезирующих ДНК (находящихся в S-фазе клеточного цикла) был использован модифициронный нуклеотид 5-этинил-2’-дезоксиуридин (EdU) (Lumiprobe), встраивающийся в ДНК во время ее синтеза. Для выявления клеток в поздней G2-фазе и M-фазе клеточного цикла использовали антитела против фосфорилированного гистона-3. Для включения EdU в ДНК клеток в S-фазе агрегаты инкубировали 24 ч в 100 мкM растворе EdU в СМВ при температуре 10-14°С. После инкубации агрегаты дважды отмывали от EdU в СМВ и фиксировали 4% PFA на PBS в течение 8-12 ч при температуре 4°С. Для изучения пролиферации клеток были выбраны следующие стадии развития агрегатов: первичные агрегаты 0-24 чпд, ранние примморфы/настоящие примморфы 24-48 чпд, настоящие примморфы 3-4 спд, развитие водоносной системы (раннее)*, развитие водоносной системы (позднее)*, развитие водоносной системы (хоаноцитные камеры)*. На каждой стадии фиксировалось около 15-30 агрегатов, полученных как минимум от трех особей. Время наступления стадий отмеченных (*) варьирует в культурах, полученных от разных особей, в силу асинхронного развития агрегатов. Помимо агрегатов, пролиферация клеток была исследована в интактных тканях губки. Для включения EdU в ДНК клеток в S-фазе небольшие губки инкубировали 24 ч в 100 мкM растворе EdU в СМВ при температуре 10-14°С. После инкубации губок дважды отмывали от EdU в СМВ и фиксировали 4% PFA на PBS в течение 8-12 ч при температуре 4°С. Уровень пролиферации был исследован в двух районах тела губки: участки тканей, прилежащие к оскулюму, и участки тканей, удаленные от оскулюма. Зафиксированные образцы тканей и агрегатов либо сразу использовались для визуализации пролиферирующих клеток, либо хранились в фиксаторе при температуре 4°С до момента визуализации. Пролиферативная активность клеток в интактных тканях губки была дополнительно исследована путем оценки распределения клеток интактных тканей губки по клеточному циклу на основании количественной оценки содержания в них ДНК с помощью проточного цитофлуориметра. Для этого ткани губок диссоциировали в БКМВ в течение 1,5 часа; в ходе этого процесса каждые 30 мин меняли БКМВ на свежую (перед этим клетки осаждали цетрифугированием при 750g, 5 мин) и периодически пипетировали суспензию, чтобы разбить кластеры клеток. Полученную суспензию клеток фиксировали ледяным 70% этанолом (перед этим клетки осаждали цетрифугированием при 750g, 5 мин) и хранили при -20С. Исследования апоптоза Для выявления апоптотирующих клеток был использован набор реактивов Click-iT TUNEL AlexaFluor 647 (Thermo Fisher), который выявляет двуцепочечные разрывы ДНК, возникающие на поздних стадиях апоптоза. Для этих исследований агрегаты фиксировали 4% PFA PBS в течение 8-12 ч при температуре 4°С. Для изучения апоптоза были выбраны следующие стадии развития агрегатов: первичные агрегаты 3 чпд, первичные агрегаты 12 чпд, ранние примморфы/настоящие примморфы 24 чпд, настоящие примморфы 3 спд, развитие водоносной системы (раннее)*, развитие водоносной системы (позднее)*. На каждой стадии фиксировалось около 15-30 агрегатов, полученных как минимум от трех особей. Время наступления стадий отмеченных (*) варьирует в культурах, полученных от разных особей, в силу асинхронного развития агрегатов. Зафиксированные образцы либо сразу использовались для визуализации апоптотирующих клеток, либо хранились в фиксаторе при температуре 4°С до момента визуализации. 6) Количественный анализ клеточной пролиферации и апоптоза в ходе реагрегации клеток и восстановления исходной организации H. dujardinii Анализ клеточной пролиферации Для визуализации клеток в S- и G2/M-фазе клеточного цикла фиксированные агрегаты и ткани губок трижды отмывали в PBS, дважды инкубировали в 1% BSA PBS, пермобилизовывали 0,5% Triton X-100 на PBS, снова дважды инкубировали в 1% BSA PBS и проводили Click-реакцию для визуализации EdU в течение 60 мин при комнатной температуре в темноте. Для проведения Click-реакции использовали следующий раствор 4мМ CuSO4, 10 мкМ Sulfo-Cyanine3 Azide (Lumiprobe), 20 mg/ml L-аскорбат натрия на PBS. После Click-реакции проводили выявление клеток в поздней G2-фазе и M-фазе клеточного цикла с помощью антител против фосфорилированного гистона-3. Для этого образцы трижды отмывали в блокирующем растворе (1% BSA, 0,1% cold‐water fish skin gelatin, 0,5% Triton X‐100, 0,05% Tween‐20 на PBS) в течение, а затем инкубировали в растворе первичных антител против фосфорилированного гистона-3 (H0412, Sigma-Aldrich) на блокирующем растворе (разведение 1:500) в течение 8-12 ч при 4°С. От первичных антител образцы трижды отмывали блокирующим растворов, а затем инкубировали в свежей порции блокирующего раствора в течение 8-12 ч при 4°С. После инкубации в блокирующем растворе образцы помещали в раствор вторичных антител Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa 647 (A-31573, Thermo Fisher Scientific) на блокирующем растворе (разведение 1:2000) в течение 8-12 ч при 4°С. Параллельно с выявлением фосфорилированного гистона-3 проводилось выявления жгутиков хоанцоитов с помощью антител против ацетилированного-альфа-тубулина (T6793, Sigma-Aldrich) (разведение 1:1000) и вторичных антител Donkey Anti-Mouse IgG Alexa 488 (A21202, Thermo Fisher Scientific). После инкубации во вторичных антителах образцы трижды отмывали PBS и проводили окрашивание ядер с помощью 2 мкг/мл раствора DAPI на PBS в течение 30 мин. После окрашивания ядер образцы трижды отмывали в PBS и заключали в 90% глицерин с 2,5% DABCO на PBS. Полученные препараты изучали на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Nikon A1 (Nikon). С каждого препарата получали один или несколько Z-стэков толщиной 20-100 мкм с шагом 1 мкм. Полученные Z-стэки изучали с помощью программ NIS Viewer v.4.5 и FiJi ImageJ v.1.52i, а затем проводили по ним количественную оценку уровня пролиферации клеток (доля клеток в S-фазе клеточного цикла и митотический индекс) в полуавтоматическом режиме с помощью программы Imaris v.7.2.1. По полученным данным для интактных тканей вычисляли среднее значение и среднеквадратичное отклонение; для агрегатов – среднее значение, медиану и дисперсию (так как в некоторых выборках доли пролиферирующих клеток демонстрирует высокую вариабельность). Для стадий развитие водоносной системы (раннее) и развитие водоносной системы (позднее) была проведена количественная оценка только доли клеток в S-фазе клеточного цикла, так как окраска антителами против фосфорилированного гистона-3 на этих стадиях не удалась. Перед исследованием на проточном цитофлуориметре суспензии клеток, полученные из интактных тканей H. dujardinii, переводили в PBS и окрашивали йодидом пропидия или Hoechst в течении 8-12 ч при комнатной температуре. Затем клетки трижды отмывали PBS и помещали в цитофлуориметр. Из полученных на цитофлуориметре событий с помощью 2х гейтов отсекали дебрис (по характеристикам SSC и FSC-A) и дуплеты (по характеристикам FSC-W и FSC-H) клеток; оставшиеся события считали одиночными клетками губки. По интенсивности флуоресценции было определено количество ДНК в каждой клетке и построена гистограмма их распределения. На основании этой гистограммы определяли долю клеток в G0/G1- (2n ДНК), S- (2n-4n ДНК) и G2/M-фазе (4n ДНК) клеточного цикла. Также была определена доля subG0/G1 клеток, содержащих менее 2n ДНК и, вероятно, являющихся апоптотирующими клетками. Всего были изучены суспензии клеток от 8 особей; по полученным данным вычисляли среднее значение и среднеквадратичное отклонение. Полученные нами данные по клеточной пролиферации в интактных тканях и многоклеточных агрегатах являются уникальными: это первое исследование уровня пролиферации в интактных тканях H. dujardinii; ранее не проводилось исследований пролиферации клеток в тканях губок с использованием двух гистохимических маркеров, дополненных данными с проточного цитофлуориметра; количественный анализ клеточной пролиферации в процессе реагрегации проведен для губок впервые. При исследовании интактных тканей H. dujardinii мы не обнаружили различий в характере пролиферации клеток в участках тела, прилежащих к оскулюму и удаленных от него (Рис. 4А; Таблица 1, 2). В обоих случаях нами было обнаружено множество клеток, синтезирующих ДНК (EdU-положительные клетки), и единичные митотические клетки (pH3-положительные клетки) (Рис. 4Б; Таблица 1, 2). В интактных тканях H. dujardinii присутствует в среднем 8,22±2,26% EdU-положительных клеток (Таблица 3). При этом большинство EdU-положительных клеток входит в состав хоаноцитных камер и, вероятно, является хоаноцитами. В мезохиле же встречаются лишь единичные EdU-положительных клетки. Так, в среднем 13,20±2,89% хоаноцитов и 1,48±0,88% клеток мезохила является EdU-положительными (Таблица 4). Доля pH3-положительных клеток значительно ниже: в среднем в тканях содержится 0,12±0,07% таких клеток (Таблица 3). Как и в случае с EdU-положительными клетками в основном pH3-положительные клетки являются хоаноцитами и лишь единичные такие клетки встречаются в мезохиле: pH3-положительными являются 0,19±0,12% хоаноцитов и всего 0,02±0,03% клеток мезохила (Таблица 4). По данным, полученным с проточного цитофлуориметра 61,4±4,54% клеток интактных тканей H. dujardinii находится в G0/G1-фазе клеточного цикла (Рис. 4В; Таблица 5). В S-фазе находится 17,1±4,45% клеток (Рис. 4В; Таблица 5), что почти в два раза превосходит значения, полученными при подсчете EdU-положительных клеток. Вероятно, проточный цитофлуориметр более чувствителен и учитывает клетки, которые могут остаться незамеченными при исследовании образцов на конфокальном микроскопе (из-за низкого уровня сигнала в этих клетках, так как экспозиция EdU попала на начало или конец их S-фазы, и они включили в свое ДНК малое количество метки). Такая же ситуация наблюдается и с митотическими клетками: по данным проточного цитофлуориметра ткани губки содержат 7,0±1,39% клеток в G2/М-фазе клеточного цикла (Рис. 4В; Таблица 5) (против всего 0,12±0,07% pH3-положительнвх клеток) (Таблица 3). Это расхождение, вероятно, частично объясняется большей чувствительностью цитофлуориметра, а также тем, что в данные цитофлуориметра включаются все клетки в G2-фазе тогда, как антитела против фосфорилированного гистона-3 выявляют только клетки в поздней G2-фазе. Доля subG1-клеток (апоптотирующих клеток) составила 10,2±4,42% (Рис. 4В). При исследованиях клеточной пролиферации в многоклеточных агрегатах нам также удалось выявить как синтезирующие ДНК, так и митотические клетки. Доля pH3-положительных клеток на изученных ранних стадиях развития агрегатов (первичные агрегаты, ранние примморфы и настоящие примморфы) был очень низким, не превышая 0,18%, что сходно с количеством митозов в интактных тканях губки (Рис. 5; Таблица 6). Доля EdU-положительных клеток была на порядок выше и менялась на разных стадиях развития (Рис. 5; Таблица 6). Наибольшая доля EdU-положительных клеток характерна для первичных агрегатов – 10,56% (Рис. 5А; Таблица 6). При трансформации первичных агрегатов в ранние и настоящие примморфы доля EdU-положительных клеток резко падает: на стадии 1-2 спд (ранние примморфы/настоящие примморфы) она составляет 1,81% (Рис. 5Б; Таблица 6), а на стадии 3-4 спд (настоящие примморфы) EdU-положительные клетки практически отсутствуют (0,01%) (Рис. 5В; Таблица 6). При этом исследованные агрегаты на стадия ранние примморфы/настоящие примморфы, 1-2 спд, вероятно, представляет собой гетерогенную выборку: среднее значение и медиана в этой выборке сильно различаются, дисперсия имеет высокое значение, а тест Крускала-Уоллиса показывает статистически значимое разделение этой выборки на две (Рис. 6; Таблица 6). В ходе прогрессивного развития примморфов и восстановления водоносной системы доля EdU-положительных клеток постепенно растет с 0,86% на ранних этапах развития (5-6 спд) до 3,86% после восстановления хоаноцитных камер (13-14 спд) (Рис. 5Г-Е; Таблица 6). Вместе с изменением доли EdU-положительных клеток меняется и их локализация в составе агрегатов: если на ранних стадиях развития (первичные агрегаты, ранние примморфы и настоящие примморфы) EdU-положительные клетки лежат равномерно в составе агрегатов, то при прогрессивном развитии агрегатов и восстановлении водоносной системы EdU-положительные клетки сначала в составе зачатков хоаноцитных камер, а затем в самих хоаноцитных камерах (Рис. 5). Таким образом, происходит восстановление нормального для интактных тканей распределения клеток, синтезирующих ДНК. Доля EdU-положительных клеток на стадии первичных агрегатов (Таблица 6) близка к доле этих клеток в интактных тканях губки (Таблица 3). Вероятно, все EdU-положительные клетки в составе первичных агрегатов начали синтез ДНК еще находясь под действием сигнальной системы интактных тканей, то есть синтез клетками ДНК на этой стадии не связан непосредственно с процессов реагрегации. При трансформации первичных агрегатов в примморфы доля EdU-положительных клеток падает (Таблица 6), так как, вероятно, на этой стадии в агрегатах еще не восстановилась сигнальная система, регулирующая клеточную пролиферацию. При этом полное исчезновение EdU-положительных клеток, видимо, совпадает с моментом эпителизации агрегатов, то есть с формированием настоящих примморфов. От стадии первичных агрегатов до стадии настоящих примморфов доля EdU-положительных клеток должна падать постепенно по мере того, как клетки, получившие сигнал еще в интактных тканях, заканчивают синтез ДНК. Такой сценарий хорошо объясняет гетерогенность агрегатов на стадии 1-2 спд: поскольку даже в пределах одной культуры агрегаты развиваются асинхронно, агрегаты возрастом 1-2 спд, попавшие в нашу выборку, могут представлять собой смесь ранних примморфов (доля EdU-положительных клеток 2,49-7,02%) и настоящих примморфов (доля EdU-положительных клеток 0,00-1,59%) (Рис. 6). При дальнейшем прогрессивном развитии происходит восстановление не только анатомических структур, но систем внутриорганизменного сигналлинга, что в свою очередь приводит восстановлению пролиферативной активности клеток, характерной для интактных тканей (Таблица 6). На самой поздней изученной нами стадии реагрегации (восстановление хоаноцитных камер) (Таблица 6) доля EdU-положительных клеток еще существенно меньше доли этих клеток в интактных тканях (Таблица 3). Вероятно, при дальнейшем развитии агрегатов доля EdU-положительных клеток будет постепенно расти и достигнет интактного уровня. Чтобы в этом разобраться в следующих год выполнения гранта нами будут исследованы две последние стадии реагрегации клеток H. dujardinii – агрегаты с зачатками оскулюмов и полностью восстановившиеся губки. Кроме того, ясно, что клеточная пролиферация на поздних стадиях реагрегации непосредственно связана с этим процессом, однако остается непонятным необходима ли она для прогрессивного развития агрегатов. Этот вопрос также будет исследован нами путем экспериментальной блокировки клеточной пролиферации в развивающихся агрегатах. Анализ апоптоза Для визуализации апоптотирующих клеток фиксированные агрегаты дважды отмывали в PBS в и пермобилизовывали 0,5% Triton X-100 на PBS. После пермобилизации проводили TdT-реакцию: сначала образцы инкубировали в TdT буфере 30 мин при комнатной температуре, а затем проводили TdT-реакцию в соответствии с инструкциями производителя в течении 8-12 ч при комнатной температуре. После TdT-реакции образцы дважды отмывали 1% BSA PBS и проводили Click-реакцию соответствии с инструкциями производителя в течении 30 мин при комнатной температуре в темноте. Затем образцы дважды отмывали 1% BSA PBS в течении 10 мин и проводили окрашивание ядер с помощью 2 мкг/мл раствора DAPI на PBS в течение 30 мин. После окрашивания ядер образцы трижды отмывали в PBS и заключали в 90% глицерин с 2,5% DABCO на PBS. Для контроля качества и специфичности окрашивания использовали положительные и отрицательные технические контроли. Для получения образцов положительного контроля ткани перед проведением TdT-реакции инкубировали в растворе ДНКазы I в течении 30 мин при 37°С. Затем эти образцы обрабатывали также как экспериментальные. Для получения образцов отрицательного контроля проводили TdT-реакцию без фермента TdT. В остальном эти образцы обрабатывали также как экспериментальные. Полученные препараты изучали на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Nikon A1 (Nikon). С каждого препарата получали один или несколько Z-стэков толщиной 20-50 мкм с шагом 1 мкм. Полученные Z-стэки изучали с помощью программ NIS Viewer v.4.5 и FiJi ImageJ v.1.52i. В ходе исследований зафиксированных агрегатов H. dujardinii нам впервые удалось успешно провести надежную визуализацию апоптотирующих клеток в составе многоклеточных агрегатов с помощью метода TUNEL (Рис. 7, 8). Тем не менее, и образцах положительного контроля и в экспериментальных образцах интенсивность флуоресценции в канале TUNEL была очень низкой, что сильно затруднило их исследование. В связи с этим мы провели исследования только ранних стадий реагрегации – первичные агрегаты 3 чпд и ранние примморфы 12 чпд. В агрегатах обоих типов были обнаружены единичные TUNEL-положительные клетки (Рис. 8). Остальные зафиксированные образцы мы планируем исследовать, используя модифицированные протокол окраски. В TdT-реакции мы планируем заменить стандартные EdUTP нуклеотиды на EdU. После TdT-реакции мы произведем визуализацию EdU с помощью, отработанной у нас Click-реакции в смеси 4мМ CuSO4, 10 мкМ Sulfo-Cyanine3 Azide (Lumiprobe), 20 mg/ml L-аскорбат натрия на PBS. Использование этого протокола Click-реакции при исследованиях пролиферации позволяет получать высокую интенсивность сигнала. 7) Тестовые эксперименты по функциональному (ингибиторному) анализу роли канонического сигнального пути Wnt, подобрать эффективные концентрации фармакологических агентов Для определения эффективных концентраций фармакологических агентов, модулирующих активность Wnt-каскада (1-азакенпауллона, броминдирубиноксима (BIO), iCRT-14 и PNU-74654), нами были проведены эксперименты по их воздействию на развивающиеся многоклеточные агрегаты. В качестве начальных точек были использованы концентрации, определенные параллельно для взрослых губок как концентрации, при которых ингибируется регенерация утраченной части тела, но не наблюдается внешних проявлений токсических эффектов в виде гибели тканей животного. Для H. dujardini они были определены как 5 мкМ для 1-азакенпауллона, 0,1 мкМ для BIO, 0.25 мкМ для iCRT-14, и 5 мкМ для PNU-74654. На многоклеточных агрегатах были проверены концентрации 10 и 15 мкМ для 1-азакенпауллона, 0.5 мкМ для BIO, 0.5 и 2.5 мкМ для iCRT-14, и 10 и 25 мкМ для PNU-74654. В эксперименте к 4-суточным примморфам, находящимся в лунках планшета в известном объеме СВМ, добавляли стоковые растворы агентов в DMSO до указанных концентраций. Через 24 и 36 часов наблюдали состояние примморф под стереомикроскопом. Для оценки влияния на пролиферативную активность одновременно с ингибитором добавляли EdU до конечной концентрации 100 мкМ, и через 24 ч фиксировали примморфы. В контроле (как для определения токсичности, так и для EdU) в лунку добавляли 1/100 объема ДМСО, до конечной концентрации 1%. Примморфы, инкубированные в перечисленных фармакологических агентах в течение 36 ч не демонстрировали признаки гибели или распада. Наоборот, для iCRT-14 0.25 мкМ и 0.5 мкМ, PNU 10 мкМ, наблюдалось развитие водоносной системы. Следовательно, трехкратное превышение концентраций, установленных для взрослой губки, не оказывает токсического эффекта на примморфы. Оценки изменения пролиферативной активности не показали отличий между контролями и образцами после модуляции сигнального каскада; однако, это может быть вызвано чрезвычайно низкой пролиферативной активностью в указанный период (5 суток после диссоциации). 8) Оптимизация протокола гибридизации in situ для многоклеточных агрегатов H. dujardinii Протокол гибридизации нуклеиновых кислот in situ (WMISH) был оптимизирован для примморфов губки Halisarca dujardini и отработан. Примморфы разных возрастов фиксировали в MEMFA (4% PFA, 2 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 100 mM MOPS pH 7.4) в течение 12 ч при комнатной температуре, затем поэтапно обезвоживали и хранили в метаноле при -20°С. Для гибридизации примморфы регидратировали в смесях метанола и PBS (70-50-30% метанол), и отмывали от следов метанола в PTW (100 mM PBS pH 7.4, 0.1% Tween-20) 5 раз по 5 мин. Затем объекты обрабатывали протеиназой К для расщепления белков в рибонуклеопротеидных комплексах с целью высвобождения РНК, в концентрации 7,5 мкг/мл в PTW в течении 15 мин при 37°С. Активность протеиназы блокировали раствором глицина в PTW в концентрации 2 мг/мл, в течение 5 мин на льду. Освобождающиеся при протеолизе концы аминокислотных цепочек блокировали ацетилированием, переводя объекты в ТЕА (триэтаноламин) в концентрации 100 mM pH 8. После ацетилирования (5 мин. в растворе 1,5 мкл/мл ТЕА и 5 мин. в растворе 3 мкл/мл ТЕА) объекты повторно фиксировали в 4% PFA в PBS для сохранения морфологии после протеолиза; фиксацию проводили в течение 30 мин – ночи при комнатной температуре на качалке. От формальдегида объекты отмывали PTW 5 раз по 5 мин. После отмывки объекты помещали в гибридизационный буфер (50% формамида, 5Х SSC, 100 мкг/мл гепарина, 5 mM EDTA pH 8, 1X раствор Денхардта, 100 мкг/мл дрожжевой РНК, 0.1% Tween-20) и после инкубации в течение 10-15 мин при комнатной температуры и смены буфера на новый, проводили пре-гибридизацию при 51°С в течение 12-16 ч. Затем буфер сменяли раствором зонда (синтезированная in vitro РНК, меченная дигоксигенин-УТФ) в гибридизационном буфере. С зондом объекты гибридизовали от 12 до 48 ч. Отмывку от зонда проводили буфером с убывающей ионной силой и концентрацией формамида по 10 мин (гибридизационный буфер – 1 раз; 50% формамида/4Х SSC/0.1% Tween-20 – 2 раза; 50% формамида/2Х SSC/0.1% Tween-20 – 2 раза; 25% формамида/2Х SSC/0.1% Tween-20 – 2 раза), и 2Х SSC – 3 раза по 20 мин. Затем SSC заменяли на MAB (малеиново-кислый буфер) – 100 mM малеиновой кислоты рН 7.5, 125 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Неспецифическое связывание антител к дигоксигенину блокировали 2% раствором Blocking reagent (Roche) в MAB в течение 1 ч при комнатной температуре на качалке. Инкубацию в антителах к дигоксигенину, конъюгированных со щелочной фосфатазой (Roche), в концентрации 1:1000 в блокирующем буфере проводили в течение 12 ч при 4°С на качалке. От антител отмывали 6 раз по 30 мин в MAB и переводили в буфер для щелочной фосфатазы (100 mM Tris-HCl pH 9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 0.1% Tween-20). Окраску проявляли с субстратом NBT/BCIP в буфере для щелочной фосфатазы, при комнатной температуре, контролируя ее развитие каждые 30 мин под бинокуляром. Процесс развития окраски останавливали, сменяя субстрат PBS с добавлением 0.5% Tween-20. После отмывки от субстрата объекты просветляли в тиодиэтаноле и монтировали препараты для микроскопии. Нами впервые была проведена гибридизация in situ на примморфах. Была выявлена экспрессия генов wnt-лиганда HdWntG и специфичного для хоаноцитов нового белка (транскрипт №43975) (Рис. 9). HdWntG в большинстве исследованных агрегатов имел цитоплазматическую локализацию в отдельных клетках в составе примморфов (Рис. 9А). Эти клетки имели амебоидную форму и, вероятно, являются часть гетерогенного пула амебоцитов (который формируется на ранних этапах реагрегации клеток H. dujardinii из амебоцитов интактных тканей и дедифференцирующихся клеток других типов (Lavrov et al., 2016). Кроме того, в нескольких крупных примморфах была выявлена диффузная экспрессия HdWntG на одном из полюсов агрегатов (Рис. 9Б). Экспрессия транскрипта №43975 была обнаружена на наиболее поздних исследованных стадиях реагрегации (12 спд) во время развития водоносной системы. В этих агрегатах экспрессия транскрипта №43975 выявляется в составе плотных скоплений клеток, которые, вероятно, являются зачатками хоаноцитных камер (Рис. 9В). Таким образом, этот транскрипт может быть связана определением судьбы хоаноцитов при их дифференцировке. 9) Подготовка к печати в международном рецензируемом научном журнале Учитывая сложности, возникшие при выявлении апоптотических клеток в составе многоклеточных агрегатов H. dujardinii, а также необходимости повторить исследования пролиферации на поздних стадиях реагрегации было принято решение перенести подготовку статьи о клеточной пролиферации и апоптозе в ходе реагрегации клеток H. dujardinii пока не будет собрано достаточное количество данных. Тем не менее, опыты по реагрегации клеток H. dujardinii, проведенные в этом сезоне, позволили ли нам закончить сбор данных о внутривидовой вариабельности реагрегации клеток этого вида в зависимости от стадии репродуктивного цикла. На основании этих данных была подготовлена статья «Intraspecific variability of cell reaggregation during reproduction cycle in Demospongiae», которая была отправлена в научный журнал Zoology (Q1, IF 1.779) 14 сентября 2019. Статья прошла первый круг рецензий и была отправлена на доработку (Major Revision). Тем не менее, замечания рецензентов касаются способа представления методов и данных. Доработка статьи не требует сбора дополнительного материала. Отзывы рецензентов представлены в Приложении 2. Доработанная версия статьи будет отправлена в редакцию не позднее 18 февраля 2020. | ||
2 | 1 января 2020 г.-26 декабря 2020 г. | Клеточные и молекулярные механизмы реагрегации клеток и восстановления исходной организации у губок из классов Demospongiae и Calcarea |
Результаты этапа: Данный проект направлен на детальные исследования реагрегации клеток у губок из классов Demospongiae и Calcarea на примере беломорских видов Halisarca dujardinii и Leucosolenia variabilis. В ходе выполнения проекта в 2020 году были получены следующие результаты: - на гистологическом и ультраструктурном уровне были описаны основные морфогенезы и клеточные механизмы, обеспечивающие развитие многоклеточных агрегатов L. variabilis: трансдифференцировка клеток; мезенхимальные и эпителиальные морфогенезы, в результате которых формируется экзопинакодерма; избирательная гибель части клеток, которая приводит к формированию полостей будущей водоносной системы. - был впервые проведен количественный анализ пролиферации клеток в процессе реагрегации и развития многоклеточных агрегатов известковых и обыкновенных губок. Пролиферация клеток имеет очень низкую интенсивность на всех исследованных стадиях реагрегации L. variabilis, с повышением возраста агрегатов затухает и не вносит какой-либо существенный вклад в развития многоклеточных агрегатов этого вида. В ходе реагрегации H. dujardinii пролиферация клеток активна, начиная с самых ранних стадий. К моменту формирования настоящих примморфов пролиферация почти полностью затухает, но в ходе прогрессивного развития агрегатов снова восстанавливается до уровня интактных тканей губки. Возможно, пролиферация клеток играет значительную роль в восстановлении исходной организации губки у H. dujardinii, что будет проверено с помощью функциональных экспериментов в 2021 г. - были поставлены эксперименты, позволившие отработать методику блокировки клеточной пролиферации в многоклеточных агрегатах H. dujardinii. Эти методики будут использованы для проведения функциональных исследований для оценки роли клеточной пролиферации в прогрессивном развитии агрегатов и восстановлении исходной организации при реагрегации клеток H. dujardinii в 2021 г. - был проведен анализ интенсивности апоптоза в ходе реагрегации клеток H. dujardinii. Полученные данные указывают, что апоптоз, вероятно, принимает участие только в элиминации поврежденных в ходе диссоциации клеток на ранних этапах процесса. На более поздних исследованных стадиях развития апоптотические ядра и тельца в составе агрегатов отсутствовали. - впервые описаны паттерны экспрессии лигандов сигнального пути Wnt и Tgf-beta с помощью гибридизации in situ. На данном этапе показано, что признаки асимметричного распределения транскрипта в примморфах H. dujardinii имеет лиганды HdWntD и HdWntC и один лигандам TGF-beta. Также была оценена активность экспрессии генов по данным RNAseq для первичных многоклеточных агрегатов (24 чпд) и для развивающихся примморфов с формирующейся водоносной системой (7 спд). Многие гены не изменяют активность экспрессии между двумя группами образцов. Однако, для некоторых характерна активная экспрессия на сроке 24 чпд, снижающаяся к 7 спд. Такой характер экспрессии показывают HdWntD, HdWntH и HdWntG, а также HdTGFb_5317 и HdTGFb_8329. - результаты, полученные при выполнении гранта, были доложены на 3 всероссийских и международных конференциях. Опубликована статья в международном научном журнале Zoology (IF 1.681). Принята в печать методологическая статья в книжную серию Methods in Molecular Biology и будет опубликована весной 2021 г. Идет работа над двумя статьями по разнообразию восстановительных процессов у губок для спецвыпуска журнала Genes (IF 3.759). Также по материалам гранта опубликована 1 статья в сборнике, 2 тезисов докладов, защищены 1 бакалаврский и 1 магистерский дипломы. Таким образом, все задачи, поставленные на 2020 год, были успешно выполнены. | ||
3 | 1 января 2021 г.-28 декабря 2021 г. | Клеточные и молекулярные механизмы реагрегации клеток и восстановления исходной организации у губок из классов Demospongiae и Calcarea |
Результаты этапа: - Оценено влияние на процесс реагрегации клеток L. variabilis метода диссоциации тканей, исходной концентрации клеток в суспензии, температуры культивирования и времени содержания культур на орбитальном шейкере. В результате комбинирования оптимальных условий было индуцировано прогрессивное развитие агрегатов этого вида, при котором начиналось восстановление водоносной системы и скелета. - На гистологическом и ультраструктурном уровне были описаны основные морфогенезы и клеточные механизмы, обеспечивающие развитие многоклеточных агрегатов L. variabilis: массовая дедифференцировка клеток в начале реагрегации; трансдифференцировка клеток при формировании примморфов и их прогрессивном развитии; мезенхимальные и эпителиальные морфогенезы, в результате которых формируется экзопинакодерма; избирательная гибель части клеток, которая приводит к формированию полостей будущей водоносной системы. - В результате серии экспериментов и тестирования нескольких методик получения агрегатов был впервые отработан метод получения агрегатов H. dujardinii, состоящих из определенного числа клеток. Эта методика позволит стандартизировать эксперименты с агрегатами. - Был впервые проведен количественный анализ пролиферации клеток в процессе реагрегации и развития многоклеточных агрегатов известковых и обыкновенных губок. Пролиферация клеток имеет очень низкую интенсивность на всех исследованных стадиях реагрегации L. variabilis, с повышением возраста агрегатов затухает и не вносит какой-либо существенный вклад в развития многоклеточных агрегатов этого вида. В ходе реагрегации H. dujardinii пролиферация клеток активна, начиная с самых ранних стадий. К моменту формирования настоящих примморфов пролиферация почти полностью затухает, но в ходе прогрессивного развития агрегатов снова восстанавливается до уровня интактных тканей губки. - Эксперименты для оценки роли клеточной пролиферации в развитии многоклеточных агрегатах H. dujardinii с помощью ее долгосрочной блокировки показали, что отсутствие пролиферации не оказывает значительного влияния на развитие агрегатов. Вероятно, высокий уровень пролиферации на ранних этапах реагрегации не связан с процессами развития самих агрегатов, являясь продолжением процессов деления клеток, которые были запущены в клеточный цикл в интактных тканях губки до диссоциации; а постепенное возрастание уровня пролиферации по мере прогрессивного развития агрегатов является отражением восстановления механизмов поддержания тканевого гомеостаза новой губки. - Был проведен анализ интенсивности апоптоза в ходе реагрегации клеток H. dujardinii. Полученные данные указывают, что апоптоз, вероятно, принимает участие только в элиминации поврежденных в ходе диссоциации клеток на ранних этапах процесса. На более поздних исследованных стадиях развития апоптотические ядра и тельца в составе агрегатов отсутствовали. - Исследование активности генов сигнальных путей Wnt и TGF-beta методами RNA-seq и гибридизации нуклеиновых кислот in situ выявило пространственно-временные изменения экспрессии некоторых их них. Так, лиганды Wnt и TGF-beta дифференциально экспрессируются при развитии агрегатов; транскрипты некоторых генов локализованы на полюсах агрегатов, формируя градиенты. Вероятно, эти сигнальные пути вовлечены в закладку и формирование новой оси восстановляющейся губки в ходе прогрессивного развития примморфов. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".