ИСТИНА

Карцинома яичника является главной причиной смертности среди пациенток, страдающих от рака половых органов. На сегодня этот диагноз встречается в среднем у 10-12 женщин из 1000. При этом средняя 5-летняя выживаемость составляет 45%. Ранняя диагностика (до распространения опухоли за пределы органа) повышает выживаемость до 90%. Для мониторинга течения болезни и оценки эффективности терапии используются уровень белков СA-125 (углеводный антиген 125) и HE4 (человеческий эпидидимальный протеин 4), которые, к сожалению, не дают полной картины, позволяющей контролировать эффективность хирургического лечения карциномы яичников. Каспаза-2, как член семейства цистеиновых протеаз, главных ферментов апоптоза, обладает не только проапоптотическими, но и онкосупрессорными функциями, а также функциями поддержания генетической стабильности, и играет одну из ключевых ролей в запуске апоптотической гибели клеток в ответ на генотоксический стресс. Эксперименты с нокаутными по каспазе-2 мышами показали, что опухоли яичника в них отличаются по чувствительности к терапии от нормальных мышей. Успешное лечение рака яичника заключается в хирургическом вмешательстве и последующей терапии. Для разработки персонифицированных прогностических и таргетных подходов оценки эффективности хирургического лечения опухолей яичника будет исследован уровень экспрессии гена каспазы-2 и его мутаций, изоформ мРНК в сопоставлении с анализом белков СA-125 и HE4. С помощью методов Вестерн-блота с последующим количественным анализом, секвенирования следующего поколения (next-generation sequencing) и ПЦР в реальном времени будет проведена оценка уровня каспазы-2 и других проапоптотических факторов в нормальных и опухолевых образцах, полученных от больных с раком яичников. Будет проанализировано соотношение мРНК, кодирующих ее проапоптотическую L- и антиапоптотическую S-изоформы. Научная новизна исследования заключается в детальном анализе генетических изменений каспазы-2 в образцах, полученных от больных раком яичников, а также в возможности их использования в сопоставлении с белками СA-125 и HE4 в качестве прогностического фактора хирургического лечения данного заболевания. Уровень значимости подобного исследования трудно переоценить в связи с социальной ролью болезни. Междисциплинарность проекта заключается в комплексном подходе, включающим биохимический, молекулярно- и клеточно-биологический анализы в тесной совокупности с генетическими и клиническими исследованиями. Именно поэтому планируемый многофакторный анализ роли онкосупрессорного белка каспазы-2 в течении заболевания даст возможность использовать его в качестве нового молекулярно-генетического прогностического фактора контроля эффективности хирургического лечения карциномы яичников.

Ovarian carcinoma is the main cause of death among patients suffering from genital cancers. Today, 10-12 women out of 1000 are suffering this disease. Unfortunately, the average 5-year survival rate of diagnosed patients is 45%. Early diagnosis (before the spread of the tumor beyond the organ) raises the survival rate to 90%. To monitor the course of the disease and evaluate the effectiveness of therapy, the level of proteins CA-125 (carbohydrate antigen 125) and HE4 (human epididymal protein 4) is analysed, which, unfortunately, does not give a complete picture allowing to control the effectiveness of surgical treatment of ovarian carcinoma. Caspase-2, as a member of the family of cysteine proteases, the main enzymes of apoptosis, fulfil not only pro-apoptotic but also tumor suppressor functions, as well as maintains genetic stability, and plays a key role in triggering apoptotic cell death in response to genotoxic stress. Experiments with caspase-2 knockout mice showed that the ovarian tumors in these animals differ in sensitivity to therapy from normal littermates. Successful treatment of ovarian cancer consists of surgical intervention and subsequent therapy. To develop personalized prognostic and targeted approaches to assess the effectiveness of surgical treatment of ovarian tumors, the level of expression of the caspase-2 gene and its mutations, mRNA isoforms compared with the analysis of proteins CA-125 and HE4 will be investigated. Using western blot technique with subsequent quantitative analysis, next-generation sequencing and real-time PCR, the level of caspase-2 and other pro-apoptotic factors in normal and tumor samples obtained from patients with ovarian cancer will be analysed. The ratio of mRNA encoding its pro-apoptotic L- and anti-apoptotic S-isoforms will be investigated. The scientific novelty of this study consists includes a detailed analysis of the genetic changes in caspase-2 in samples obtained from patients with ovarian cancer, and in the possibility of using them in comparison with the proteins CA-125 and HE4 as a prognostic factor for the surgical treatment of this disease. The significance of such a study cannot be overestimated keeping in mind the social role of this disease. The interdisciplinarity of the project is based on the complex approach, including biochemical, molecular and cell-biological analyses in close conjunction with genetic and clinical studies. That is why the planned multifactorial analysis of the role of the tumor suppressor protein caspase-2 in the course of the disease will make it possible to use it as a new molecular genetic prognostic factor controlling the effectiveness of surgical treatment of ovarian carcinoma.

В ходе выполнения работы планируется: 1. Получить данные о различных параметрах каспазы-2 как прогностического маркера при хирургическом лечении и последующей терапии опухолей яичников и сравнить их с используемым в настоящее время прогностическими факторами СA-125 и HE4. 2. Полученные ранее в нашей лаборатории данные свидетельствуют, что обработка химиотерапевтическими препаратами раковых клеток линии карциномы яичников приводит к индукции нескольких типов клеточной гибели – апоптоза, некроптоза и митотической катастрофы. Дальнейшее исследование позволит определить роль данного белка в индукции гибели опухолевых клеток в тканях пациентов. 3. Поскольку существуют предпосылки участия каспазы-2 не только непосредственно в апоптозе, но и в других процессах, вызванных повреждениями ДНК, то также будут получены данные о влиянии каспазы-2 на систему детекции повреждений ДНК и запуск р53-опосредованного молекулярного пути гибели раковых клеток. 4. Совмещение молекулярно-генетического анализа (секвенирование) и медицинского подхода в отображении клинической картины течения заболевания у пациентов позволит сделать выводы о роли каспазы-2 в прогрессировании опухоли, степени ее агрессивности и перспективности хирургического и последующего терапевтического лечения. Таким образом, будет впервые непосредственно показана роль каспазы-2 как прогностического фактора при хирургическом лечении и последующей терапии опухолей яичников.

Forsberg J., Zhivotovsky B., Olsson M. Caspase-2 – an orphan enzyme out of the shadows. Oncogene, издательство Nature Publishing Group (United Kingdom), том 36, с. 5441-5444 Aksenova V.I., Kopeina G.S., Zamaraev A.V., Zhivotovsky B.D., Lavrik I.N. Mechanism of caspase-2 activation upon DNA damage. Doklady Biochemistry and Biophysics, издательство M A I K Nauka - Interperiodica (Russian Federation), том 467, № 1, с. 132-135

В результате выполнения данного проекта нами получены новые данные о различных параметрах каспазы-2 как прогностического маркера при хирургическом лечении и последующей терапии опухолей яичников. Установлено, что в зависимости от концентрации обработка химиотерапевтическими препаратами раковых клеток линии карциномы яичников приводит как к индукции апоптоза и некроптоза, так и к состоянию митотической катастрофы, которая в дальнейшем может быть реализована в виде апоптоза, некроптоза или аутофагии. Нами показана роль каспазы-2 в детекции повреждений ДНК и в зависимом от белка р53 апоптозе раковых клеток. Впервые показана роль каспазы-2 в негативной регуляции некроптоза. Было показано, что в образцах карциномы яичника происходит снижение уровня каспазы-2 по сравнению с нормальными тканями того же пациента. При этом повышался уровень каспазы-8 и каспазы-3. Нами было выполнено таргетное секвенирование экзонов гена CASP2 и фланкирующих интронных последовательностей в интраоперационных биоматериалах большинства пациентов, включённых в исследование. При анализе данных NGS не было выявлено значимого мозаицизма в исследуемых биоптатах. Всего было выявлено 7 полиморфных локусов. Кроме того, нами был выполнен сравнительный анализ уровней мРНК обеих изоформ каспазы-2 — каспазы-2L и каспазы-2S — в ряде образцов здоровых и поражённых участков яичников пациентов с раком яичника. На основании полученных данных были определены соотношения уровней транскриптов в проанализированных образцах биоматериалов. Нормализация уровня мРНК длинной изоформы каспазы-2 по уровню мРНК микроглобулина показала разброс относительных количеств каспазы-2L в образцах яичников женщин, больных раком этого органа, более чем на 2 порядка (и более чем на порядок при исключении крайних значений). Таким образом, совмещение молекулярно-генетического анализа (секвенирование) и медицинского подхода в отображении клинической картины течения заболевания у пациентов позволило сделать выводы о роли каспазы-2 в прогрессировании опухоли, степени ее агрессивности и перспективности хирургического и последующего терапевтического лечения.