ИСТИНА

Ранее в нашей лаборатории было показано, что при нагревании вируса табачной мозаики (ВТМ, род Tobamovirus, семейство Virgaviridae) до 94°С происходит денатурация белка оболочки ВТМ, и формируются структурно модифицированные частицы сферической формы свободные от вирусной РНК. ВТМ это палочковидный вирус растений со спиральным типом симметрии и обладающий достаточно жесткой структурой. Целью предлагаемого проекта является сравнительное изучение процессов термической перестройки вирусов с различными типами симметрии капсида. В ходе выполнения работы будут исследованы условия термической перестройки вирионов и их зависимость от структуры вирусов. Также будут изучены морфология и состав структурно модифицированных вирусоподобных частиц, полученных при нагревании вирусных препаратов (70-98°С). Сведения о структурной модификации вирусов могут быть полезны в разработке методов направленной защиты сельскохозяйственных животных и растений, а также для создания новых биотехнологий в ветеринарии и медицине.

Previously our laboratory shown that heating of tobacco mosaic virus (TMV, genus Tobamovirus, family Virgaviridae) at 94°C leads to TMV coat protein denaturation and formation of RNA-free structurally modified particles with spherical shape. TMV is a rod-shaped plant virus with helical symmetry and rather rigid structure. The purpose of the proposed project is a comparative study of the thermal remodelling of viruses with different types of capsid symmetry. During the project the conditions of thermal remodelling and their dependence on the structure of viruses will be studied. Morphology and composition of the structurally modified virus-like particles, derived from virus preparations by heating (70-98 ° C) will be analyzed. Information about the structural modification of viruses may be useful in the development of methods designed to protect livestock and plants, as well as in the development of new biotechnologies for veterinary and medicine.

В результате выполнения проекта будут получены данные о возможности создания биогенных частиц белковой природы на основе вирионов с различным типом симметрии и изучены их свойства. В процессе выполнения проекта будут впервые получены данные о влиянии температуры (70-98°С) на структуру вирионов со спиральным и икосаэдрическим типом симметрии. Впервые будет определено влияние вида вирионов – жесткие палочковидные (вирус мозаики долихоса, вирус штриховатой мозаики ячменя, вирус погремковости табака) или гибкие нитевидные (А вирус картофеля, вирус мозаики альтернантеры,) – на возможность и условия термической перестройки вирусов со спиральным типом симметрии. Будут охарактеризованы структурно модифицированные частицы (СЧ), полученные при термической перестройке вирусов из различных таксономических групп. Впервые будут получены сведения о возможности термической перестройки представителей семейств Potyviridae, Caulimoviridae, Tombusviridae и др. С помощью методов электронной микроскопии, динамического рассеяния света и метода анализа траекторий наночастиц будут получены сведения о размерах структурно модифицированных частиц. Метод анализа траекторий наночастиц позволит проанализировать агрегационные свойства СЧ в жидкости. Будет изучена возможность адсорбции чужеродных белков на поверхности, полученных структурно модифицированных частиц по аналогии с тем, как это было сделано для СЧ ВТМ (Karpova et al., 2012; Nikitin et al., 2013).

В распоряжении коллектива находится уникальная коллекция вирусов растений кафедры вирусологии МГУ имени М.В.Ломоносова, большой опыт в изучении структуры и свойств вирусов растений со спиральной и икосаэдрической структурой, а также в методах получения и очистки вирусных препаратов и в выделении отдельных компонентов вирионов. Ранее на примере вируса табачной мозаики впервые было продемонстрирован феномен термической перестройки палочковидных вирионов в структурно модифицированные частицы сферической формы с уникальными свойствами (Atabekov et al., 2011; Nikitin et al., 2011; Karpova et al., 2012; Nikitin et al., 2013; Dobrov et al., 2014; Trifonova et al., 2014a). Результаты исследований опубликованы в ведущих отечественных и зарубежных журналах с высоким индексом цитируемости. Биологический факультет МГУ и кафедра вирусологии располагают новейшим оборудованием, позволяющим проводить исследования в области молекулярной вирусологии любого уровня сложности на самых разных объектах. Кафедра вирусологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова располагает новейшей компьютерной техникой и программным обеспечением.

В настоящей работе была изучена возможность получения структурно модифицированных частиц при термической перестройке вирионов икосаэдрических и спиральных вирусов, относящихся к различным таксономическим группам. В качестве представителей вирусов с палочковидными вирионами и спиральным типом симметрии были выбраны вирус мозаики долихоса (вирус кроталярии индийской) (ВМД), представитель рода Tobamovirus, семейства Virgaviridae; вирус штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ), представитель рода Hordeivirus, семейства Virgaviridae; вирус погремковасти табаки (ВПТ), представитель рода Tobravirus, семейства Virgaviridae Также были использованы нитевидные вирионы и вирусоподобные частицы вируса мозаики альтернантеры (ВМАльт, представитель рода Potexvirus, семейства Alphaflexiviridae) и нитевидные вирионы А вируса картофеля (АВК представитель рода Potyvirus, семейства Potyviridae). Вирусы с икосаэдрическим типом симметрии были представлены вирусом мягкой мозаики фасоли (ВММФ), представитель семейства Tombusviridae; вирусом мозаики цветной капусты (ВМЦК), представитель рода Caulimavirus, семейства Caulimaviridae; вирусом энцефаломиокардита, представитель рода Cardiovirus, семейства Picornaviridae, Ранее мы показали, что температурная обработка вируса табачной мозаики (ВТМ) и Х-вируса картофеля (ХВК) позволяет получить новый вид уникальных платформ-носителей (Atabekov et al., 2011; Trifonova et al., 2015; Nikitin et al., 2016). Продемонстрированы перспективы применения платформ на основе структурно модифицированных частиц сферической формы (СЧ) ВТМ при получении биологически активных комплексов, в частности кандидатных вакцин и биоконтрастеров (Bruckman et al., 2013; Trifonova et al., 2017). В настоящей работе явление термической перестройки было изучено у фитовирусов с различной морфологией вирионов (палочковидные, нитивидные, сферические). Термическая перестройка вирусов с палочковидными вирионами была показана на примере вируса мозаики долихоса (ВМД) и вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ). ВМД – родственник ВТМ и, как все представители рода Tobamovirus, обладает сходными с ВТМ параметрами спирали и структурой (Stubbs et al., 2005). Однако в отличие от ВТМ, у которого основными хозяевами являются представители семейства Solanacea, ВМД поражает в основном зернобобовые культуры. Палочковидные вирионы ВМД имеют длину 300 нм и диаметр 17 нм. Препараты ВМД неоднородны по длине и содержат короткие вирионы (около 40 нм), несущие в своем составе субгеномные РНК. Данная особенность является важным отличием ВМД от ВТМ. ВШМЯ – типичный представитель рода Hordeivirus. Ячмень (Hordeum vulgare) и пшеница (Triticum aestivum) являются природными хозяевами этого вируса. Геном ВШМЯ (штамм ND 18) разделен на 3 молекулы одноцепочечной РНК положительной полярности. Сегменты распределены по разным жестким палочковидным вирусным частицам со спиральным типом симметрии и длиной в диапазоне 110-150 нм. Недавно с помощью криоэлектронной микроскопии было продемонстрировано, что в составе препаратов ВШМЯ присутствуют вирионы с широким (22,4 нм) и узким диаметром (21,6 нм) (Clare et al., 2015), и выдвинуто предположение, что такие вирионы являются конформационными формами ВШМЯ. Таким образом, структура ВШМЯ более лабильна и гетерогенна, чем структура представителей рода Tobamovirus (Clare et al., 2015; Solovyev & Makarov, 2016). Термическую обработку палочковидных вирусов проводили по методике, отработанной ранее для ВТМ. Продемонстрировано, что при термической обработке ВМД и ВШМЯ при 94°С образуются СЧ. Как и в случае с ВТМ, процесс образования СЧ из ВМД и ВШМЯ является двухстадийным. На первой стадии при нагревании вируса до 90°С происходит сворачивание вириона с одного или двух концов и образование промежуточной формы. Последующее повышение температуры до 94°С приводит к 100% преобразованию промежуточных форм в СЧ. Дальнейшее нагревание препаратов и увеличение температуры инкубации от 94°С до 98°С не приводило к видимым изменениям размеров или морфологии СЧ. При термической обработке ВМД и ВШМЯ при 70°С морфологических изменений вирионов отмечено не было. Таким образом, продемонстрировано, что термическая перестройка не только ВТМ, но и других палочковидных вирусов происходит при 94°С, а не при более низкой температуре, как у нитевидного ХВК (90°С). С помощью ЭМ были проанализированы сферические частицы, образующиеся при 94°С из препаратов ВМД с концентрацией 0,1, 1 и 10 мг/мл. Полученные микрофотографии были обработаны с помощью программы ImageJ (Национальный институт здоровья, США), которая позволила рассчитать средний диаметр СЧ. Средний диаметр СЧ ВМД составил 60±8, 310±15, 690±60 нм для концентраций 0,1, 1 и 10 мг/мл соответственно. Таким образом, было обнаружено, что размеры СЧ ВМД зависят от исходной концентрации препарата вируса. Полученная зависимость была аналогична зависимости, обнаруженной ранее для ВТМ, что можно объяснить их сходными структурными характеристиками. Для ВШМЯ было показано, что из вируса с концентрацией 0,1 мг/мл образуются СЧ ВШМЯ со средним диаметром 265±18 нм, а при концентрации 1 мг/мл образуются СЧ ВШМЯ со средним диаметром 280±16 нм. Дальнейшее повышение концентрации ВШМЯ не приводило к значимому увеличению размеров образующихся СЧ. Следовательно, в случае с СЧ ВШМЯ не было выявлено строгой зависимости размеров частиц от исходной концентрации вируса. Можно предположить, что это связно с гораздо большей гетерогеннностью препарата ВШМЯ по сравнению с ВМД, причем не только по длине, но и по диаметру вирусных частиц. При нагревании еще одного вируса с палочковидным вирионом – вируса погремковости табака при 94°С наблюдалось образование крупных переплетенных между собой сетей. Повышение или понижение температуры обработки не приводило к каким-либо изменениям. Таким образом, при термической обработке ВПТ не удалось получить частицы с четкой сферической морфологией, хотя изменения в состоянии вирионов были зафиксированы. Микроскопические методы анализа, как правило, связаны с высушиванием образца на подложке, что может привести к искажению получаемых результатов. Для определения размеров СЧ ВМД и СЧ ВШМЯ в жидкости был использован метод динамического рассеяния света (ДРС) и метод анализа траекторий наночастиц (АТН). СЧ, полученные при нагревании препаратов ВМД с исходной концентрацией 0.1, 1 и 10 мг/мл и СЧ, полученные при нагревании препаратов ВШМЯ с исходной концентрацией 0.1 и 1 мг/мл были исследованы с помощью этих методов. Среднее значение диаметра СЧ ВМД, определенное методом ДРС, составило 70±5, 330±10 и 720±24 нм для СЧ, образующихся при термической обработке вируса с исходной концентрацией 0.1, 1 и 10 мг/мл соответственно. Среднее значение диаметра СЧ ВШМЯ по данным ДРС составило 277±12 и 297±15 нм для исходных концентраций вируса 0.1 и 1 мг/мл. Метод ДРС не всегда дает адекватные результаты в случае полидисперсности и агрегации препарата. В отличие от ДРС метод АТН позволяет рассчитать гидродинамический диаметр каждой наблюдаемой наночастицы, значение которого затем включается в общую гистограмму распределения (Filipe et al., 2010) Таким образом, в случае полидисперсных и склонных к агрегации препаратов АТН дает возможность получить сведения о характере распределения частиц по размерам, отражающие реальную ситуацию в коллоидном растворе. Результаты АТН по распределению размеров СЧ ВМД и СЧ ВШМЯ, полученных при нагревании препаратов вирусов, свидетельствовали об отсутствие агрегации образцов. Значения среднего диаметра СЧ ВМД, рассчитанные с помощью метода АТН составили 65±2, 315±8 и 705±16 нм для концентраций 0.1, 1 и 10 мг/мл. Для СЧ ВШМЯ метод АТН показал средние значения диаметра 271±9 (при исходной концентрации ВШМЯ 0.1 мг/мл) и 280±17 (при исходной концентрации ВШМЯ 1 мг/мл). Следовательно, было показано, что результаты метода динамического рассеяния света и метода анализа траекторий наночастиц по определению среднего значения диаметра СЧ ВМД и СЧ ВШМЯ хорошо согласовывались с данными микроскопического анализа. Метод АТН позволил не только уточнить информацию о характере распределения размеров СЧ в жидкости, но также получить сведения о количестве СЧ, получаемых из 1 мг препаратов ВМД и ВШМЯ с различной исходной концентрацией. Показано, что в 1 мг препарата СЧ ВМД, полученных из вируса с исходной концентрацией 0.1, 1 и 10 мг/мл содержится 8 x 10^12, 4 x 10^11, 2 x 10^10 частиц соответственно. В 1мг СЧ ВШМЯ содержится 2.2 x 10^11 (при исходной концентрации ВШМЯ 0.1 мг/мл) и 1.8 x 10^11 частиц (при исходной концентрации ВШМЯ 1 мг/мл). Сведения о количестве СЧ в 1 мг могут быть полезны при стандартизации препаратов структурно модифицированных вирусов для их биотехнологического применения. Изучен состав СЧ ВМД и СЧ ВШМЯ. С помощью электрофореза в 1% агарозном геле и метода спектрофотометрии продемонстрировано, что в состав СЧ ВМД и СЧ ВШМЯ не входит вирусный генетический материал, вероятно, нуклеиновая кислота деградирует и высвобождается в процессе образования структурно модифицированных сферических частиц. Электрофоретический анализ в 8-20% ДСН-ПААГ показал, что при термической обработке ВМД и ВШМЯ белок оболочки вирусов не деградирует, а полипептидные цепи образующихся СЧ соответствуют по своим размерам полипептидной цепи БО ВМД и БО ВШМЯ. На следующем этапе работы была исследована возможность термической перестройки вируса с нитевидными вирионами – вирус мозаики альтернантеры (ВМАльт). ВМАльт – представитель рода Potexvirus и родственник ХВК. Вирионы ВМАльт имеют длину 570 нм и диаметр 13 нм. Вирионы ВМАльт по своим свойствам и размерам близки к ХВК, и можно было ожидать, что при их нагревании будут получены частицы, аналогичные СЧ ХВК. К нашему удивлению, при термической денатурации ВМАльт в условиях образования CЧ из ХВК наблюдалось образование структур неправильной формы, склонных к агрегации. Дальнейшее повышение температуры не приводило к каким-либо изменениям. Ранее в нашей лаборатории было показано, что БО ВМАльт, в отличие от БО ХВК, способен формировать ВПЧ in vitro в отсутствии РНК. В настоящей работе для термической обработки были использованы ВПЧ ВМАльт, сходные по длине с нативным вирусом (средняя длина ВПЧ 500 нм, диаметр 13 нм). БО ВМАльт для дальнейшей реполимеризации в ВПЧ был получен с помощью метода солевой депротеинизации в присутствии 2 M LiCl (Amresco, США). ВПЧ ВМАльт были получены при инкубации в воде высокого качества (Milli-Q , система Simplicity UV, Merck Millipore, США). При термической обработке ВПЧ ВМАльт с исходной концентрацией 0,1 и 1 мг/мл происходило образование СЧ БОВМальт с формой, близкой к сферической, и диаметром около 100 нм. Зависимости размеров образующихся СЧ от исходной концентрации ВПЧ обнаружено не было. Метод АТН продемонстрировал, что в отличие от СЧ ВМД и СЧ ВШМЯ, сферические частицы, образующиеся при термической обработке БО ВМАльт, находятся в растворе в агрегированном состоянии. Средний гидродинамический диаметр таких агрегатов по данным АТН составляет 195 нм. Электрофоретический анализ показал соответствие молекулярной массы белка, входящего в состав СЧ БОВМАльт, молекулярной массе нативного БО ВМАльт. При термической модификации другого нитевидного вируса – А вируса картофеля из семейства Potyviridae c исходной концентрацией препарата 0.1 и 1 мг/мл образование структурно модифицированных сферических частиц не наблюдалось. Электронная микроскопия термически обработанного вируса (90-98°С, 10-30 сек) показала наличие в препаратах неструктурированных крупных аморфных агрегатов, а также крупных нитчатых сетей и мелких фрагментов вирионов АВК. Возможность термической модификации вирусов с икосаэдрическим типом симметрии была изучена на примере сферических вирионов вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) (ДНК-содержащий вирус), вируса мягкой мозаики фасоли (ВММФ) (РНК-содержащий вирус, геном положительной полярности), вируса энцефаломиокардита (РНК-содержащий вирус, геном положительной полярности). Вирусы со сферической морфологией были накоплены в достаточных количествах согласно ранее описанным методикам (Trifonova et al., 2014; Nikitin et al., 2015). При нагревании препаратов ВММФ, ВМЦК и вируса энцефаломиокардита до 94-98°С структурная модификация не происходила, вирусы сохраняли свою морфологию и размеры. Изменение времени прогревания с 10 до 30 с также не приводило к изменениям вирионов. Таким образом, можно сделать вывод, что в связи с тем, что структура нитчатых вирионов и ВПЧ является гибкой, то их термическая перестройка может проходить при более низких температурах (90°С), тогда как для термической перестройки вирусов с жесткими палочковидными вирионами требуется более высокая температура (94°С). Термическая перестройка сферических вирусов не была показана. Вероятно, БО вируса, организованные в икосаэдр, обладают большей устойчивостью к термической денатурации. Получены сведения о наличии адсорбционных свойств СЧ ВМД, СЧ ВШМЯ и СЧ БОВМАльт. В качестве модельного белка был использован бычий сывороточный альбумин, меченый флуоресцеин изотиоционатом (БСАФИТЦ). Для изучения возможности образования комплексов СЧ ВМД- БСАФИТЦ, СЧ ВШМЯ- БСАФИТЦ и СЧ БОВМАльт- БСАФИТЦ проводили инкубацию 50 мкг СЧ с 10 мкг БСАФИТЦ в течении 30 мин. В дальнейшем препараты анализировали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (Axiovert 200M). Продемонстрировано, что все типы СЧ адсорбировали на своей поверхности БСАФИТЦ, следовательно, их можно рассматривать в качестве привлекательных платформ для создания функционально активных комплексов с различными целевыми белками. Все цели работы достигнуты, задачи выполнены.