ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Протеасома представляет собой мультисубъединичный белковый комплекс, обладающий протеолитической активностью. Благодаря сложной пространственной организации и широкой субстратной специфичности, протеасома принимает участие в деградации большинства внутриклеточных белков, в том числе мутантных. Белки, содержащие удлиненные полиглутаминовые (поли-Q) тракты, экспрессируются и накапливаются в нейронах, вызывая тем самым возникновение таких заболеваний, как болезнь Хантингтона, Мачадо-Джозефа, спинно-мозжечковая атаксия 1 типа и др. Такие мутантные полипептиды плохо растворимы в воде, склонны к агрегации и образованию телец включения в нейронах, что приводит к их дисфункции и гибели. Протеасома задействована в процессе деградации мутантных белков, однако как именно происходит их взаимодействие, до конца не ясно. Существуют противоречивые данные о том, подвергаются ли поли-Q участки в белках гидролизу протеасомой или же они ее ингибируют, нарушая тем самым систему деградации клеточных белков и приводя в результате к апоптозу клетки. В связи с этим, исследование гидролиза белков и пептидов, содержащих полиглутаминовые последовательности, протеасомой и изучение влияния ее различных регуляторов и субъединичного состава на этот процесс является актуальной научной задачей, решение которой может создать новое направление терапии полиглутаминовых расстройств.
The proteasome is a multisubunit protein complex possesing proteolytic activity. Due to the complex spatial organization and broad substrate specificity, proteasome participates in the degradation of the majority of intracellular proteins, including the mutant proteins. Mutant proteins containing elongated polyglutamine (poly-Q) sequences which are expressed and accumulate in neurons, caused the manifestation of Huntington's disease, Machado-Joseph disease, spinal cerebellar ataxia type 1, and others. Such mutant polypeptides are poorly soluble in water, prone to aggregation and inclusion body formation in neurons, which leads to their dysfunction and death. The proteasome is involved in the degradation of such mutant proteins, but how is their interaction occur is not fully clear. There are conflicting reports about whether the portions of poly-Q proteins are exposed to proteasome hydrolysis or they inhibit proteasome, thus violating the system of cellular proteins degradation and resulting in cell apoptosis. In this regard, the study of hydrolysis of proteins and peptides containing the polyglutamine sequence by the proteasome, and study the effect of its various regulators and subunit composition on this process is the actual scientific task that can create a new line of therapy of polyglutamine disorders.
На первом этапе планируется оптимизировать методики выделения протеасомных субчастиц 11S из тканей животных (лабораторных мышей), определить их субъединичный состав (соотношение , и γ субъединиц) и влияние на кинетические параметры гидролиза пептидных субстратов 20S и 26S протеасомой. Затем планируется изучить гидролиз полиглутамин-содержащих пептидов. В качестве таких пептидов будут использованы новые, не описанные в литературе, модифицированные синтетические пептиды с внутренним тушением флуоресценции, содержащие группы EDANS (флуорофор) и Dabcyl (тушитель). Длина полиглутаминового тракта будет составлять 5 и 10 остатков. Субстраты будут охарактеризованы спектрально и масс-спектрометрически. С помощью этих субстратов будут получены кинетические параметры гидролиза полиглутамин-содержащих пептидов протеасомными комплексами 20S, 26S, 20S+11S, 26S+11S.
Научный коллектив состоит из специалистов по молекулярной биологии, биохимии, энзимологии и биоорганической химии, а также студентов. В научном коллективе-заявителе накоплен значительный опыт по экспрессии, выделению и исследованию белков и ферментов, включая протеиназы различных классов, в том числе протеасому. Изучено действие протеасомы и каталитических антител на основной белок миелина, в ходе которого были определены сайты протеолиза ОБМ и кинетические параметры этой реакции. Имеется опыт работы с модельными животными и на клеточных линиях. В научном коллективе-заявителе используются наиболее современные методы исследования, позволяющие получать достоверные сведения о свойствах ферментов и белковых комплексов и их внутриклеточной локализации. Разработанные методы и подходы являются оригинальными, опережают аналогичные зарубежные разработки в данной области и найдут применение в заявленном проекте. В нашем распоряжении имеется необходимое оборудование для выполнения проекта или доступ к нему в рамках Центра коллективного пользования МГУ. Также есть часть реактивов и материалов, необходимых для того, чтобы начать выполнение проекта.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Деградация пептидов и белков, содержащих полиглутаминовые фрагменты, протеасомными комплексами различного состава |
Результаты этапа: В результате проделанной работы оптимизирована методика выделения протеасомного регулятора 11S из тканей лабораторных мышей с помощью комбинации хроматографических методов: гель-фильтрации и ионообменной хроматографии в режиме FPLC, определен субъединичный состав выделенных 11S субчастиц. Изучено влияние 11S регуляторных субчастиц на кинетические параметры гидролиза стандартных пептидных субстратов 20S и 26S протеасомой. Флуорогенные полиглутамил-содержащие пептиды с 5 и 10 остатками глутамина подряд, содержащие FRET-пару EDANS (флуорофор) и Dabcyl (тушитель) охарактеризованы спектральными и масс-спектрометрическими методами, изучена кинетика их гидролиза протеасомными комплексами: 20S, 26S, 20S+11S, 26S+11S. Имеющиеся в нашем распоряжении плазмиды, кодирующие ген полноразмерного хантингтина с 15 и 138 остатками глутамина подряд, были охарактеризованы: прочитана их нуклеотидная последовательность, выявлены некоторые аминокислотные замены. Показана возможность трансфекции эукариотических клеток HEK293T плазмидами, кодирующими ген полноразмерного хантингтина с 15 и 138 остатками глутамина подряд, наличие хантингтина в клетках определено с помощью флуоресцентной микроскопии и Вестерн-блоттинга. | ||
2 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Деградация пептидов и белков, содержащих полиглутаминовые фрагменты, протеасомными комплексами различного состава |
Результаты этапа: Идентифицированы сайты гидролиза пептидов, содержащих полиглутаминовые фрагменты, протеасомными комплексами 20S, 26S, 20S+11S, 26S+11S методом хромато-масс-спектрометрии. Определено, что протеасома способна гидролизовать такие пептиды, причем добавление регуляторов не меняет место протеолиза. Проведено несколько пробных экспрессий нормального и мутантного хантингтина в клетках человека. В экспрессионный вектор на С-конец введены 6хHis и 3хFLAG теги для облегчения очистки и идентификации полноразмерного хантингтина. Попытка очистки с помощью металл-хелатной хроматографии показала, что полноразмерный хантингтин плохо связывается с никель-содержащей колонкой и совыделяется с другими белками, давая несколько полос как на электрофореграмме в денатурирующих условиях при окрашивании Кумасси так и после вестерн-блоттинга при окрашивании антителами. | ||
3 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Деградация пептидов и белков, содержащих полиглутаминовые фрагменты, протеасомными комплексами различного состава |
Результаты этапа: В результате выполнения проекта методом молекулярного докинга с использованием программы Autodock Vina была изучена возможность протеолиза полиглутамин-содержащих пептидов шестью разными каталитическими субъединицами протеасомы (тремя конститутивными и тремя иммуно). Анализ полученных конформационных данных показал, что только две из шести каталитических субъединиц могут гидролизовать пептид между глутаминами, так как только в них образуется сеть водородных связей, способных фиксировать субстрат в центре связывания в конформации, подходящей для гидролиза. Проведена работа над оптимизацией схемы выделения и очистки полноразмерного нормального и мутантного хантингтина хроматографическими методами, однако пока белок в достаточных количествах получить не удалось. Исследован статус убиквитинирования нормального хантингтина и белка с удлиненным полиглутаминовым трактом. Изучена внутриклеточная активность протеасомы при транзиентной экспрессии нормального и мутантного хантингтина и показано значимое изменение одного из типов активности. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".