Оптическое исследование и клиническая верификация фундаментальных реологических механизмов обратимой агрегации эритроцитовНИР

investigation

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Оптическое исследование и клиническая верификация фундаментальных реологических механизмов обратимой агрегации эритроцитов
Результаты этапа: Мы описывали план работы по проекту в форме рабочих пакетов (work packages – WP) на весь период выполнения проекта. В соответствии с WP1 была проведена предварительная работа: 1. Получено разрешение этического комитета МГУ на проведение экспериментов с образцами крови человека. 2. Закуплены расходные материалы: одноразовые кюветы для прибора агрегометра-деформометра RheoScan, белки (альбумин человека, фибриноген, гамма-глобулин), нейтральные макромолекулы (декстраны). 3. Проведена калибровка оптической ловушки - получена зависимость силы захвата ловушки от мощности захватывающего лазерного пучка, позволяющая проводить измерения агрегации и дезагрегации эритроцитов на уровне дублетов клеток. Оптимизированы процедуры измерения СДД (минимальная Сила, необходимая для Дезагрегации Дуплета) и САД (Сила, развиваемая при Агрегации эритроцитов в процессе образования Дуплета) для достижения наибольшей чувствительности. 4. Проведено сравнение результатов измерения СНД дуплета (СНДД) и СНА дуплета, полученных на оптической ловушке, с Критическое Сдвиговое Напряжением (КСН), полученным при использовании агрегометра RheoScan. 5. Утверждены протоколы подготовки образцов для сравнения результатов измерений, полученных при использовании ОЛ (оптической ловушки) и прибора RheoScan. Разработаны протоколы измерений. 6. Уточнены отношения между параметрами, характеризующими агрегацию одиночных эритроцитов и дезагрегацию дублета эритроцитов на уровне индивидуальных клеток (САД и СДД) и в образцах цельной крови (СНД, СНА и КСН). Основные результаты, полученные в рамках рабочего пакета (WP1), продемонстрированы на рисунках 1 и 2. Разработан и оптимизирован протокол измерений САД и СДД на уровне одиночных клеток и их дуплетов с помощью ОЛ, а также приведен способ пересчета значений САД и СДД в сдвиговые напряжения для сравнения с результатами, полученными на приборе RheoScan. Наглядная иллюстрация разработанной нами процедуры измерений САД и СДД, а также пересчета сил в сдвиговые напряжения приведена схематически на рисунке 1. На рисунке 2 приведена иллюстрация измерении КСН прибором RheoScan, и приведены результаты измерений на ОЛ. Измерения были проведены на 8 условно здоровых донорах. Нами была обнаружено практическое совпадение значений КСН (CSS) и САД (SASS). На рисунке 2(с) видно, что сила дезагрегации дуплета клеток (выраженная в напряжении сдвига) СДД (SDSS) значительно превышает силу агрегации клеток САД, выраженную в напряжении сдвига (порядка 4 раз). Данные отличия статистически значимы (p<0,05). Этот факт был использован нами для того, чтобы предложить новый диагностический параметр отношения силы дезагрегации и агрегации дуплета клеток. Предлагаемый параметр может быть использован для контроля предрасположенности пациентов к различным сосудистым заболеваниям, а также для оценки эффективности терапии. Верификация данного параметра в норме и патологии, а также определение диапазонов его значений запланировано на второй год проекта. Рис. 1. Иллюстрация процедуры измерений сил взаимодействия эритроцитов. Длина стрелки показывает величину силы приложенной со стороны ОЛ (a) собирается агрегат из двух эритроцитов, используя две ОЛ; (b) измерение силы дезагрегации эритроцитов передвижением положения одной из ОЛ, при этом находится минимальная сила необходимая для разделения клеток; (c) измерение силы агрегации эритроцитов, как минимальной силы необходимой для удержание эритроцитов от спонтанной агрегации. (d) процедура расчета сдвигового напряжения действующей на пару клеток. Рис. 2. (a) Схема прибора RheoScan используемого для измерения агрегации эритроцитов, основанного на регистрации сигнала обратно рассеянного света от суспензий проходящей через микроканал под различным сдвиговым напряжением; (b) Изменение интенсивности обратно рассеянного света от времени, I – при дезагрегации и II – при агрегации, ?c – критическое сдвиговое напряжение (CSS); (c) сравнение сдвиговых напряжений измеренных прибором RheoScan и ОЛ, усредненный по 8 донороам В соответствии с WP2 была проведено исследование температурной зависимости для параметров агрегации эритроцитов и дезагрегации дублетов в аутологичной плазме. 1. Была изготовлена камера с контролируемой температурой для работы ОЛ в температурном диапазоне от 20°С до 40°С. 2. Выполнена серия экспериментов с помощью ОЛ и прибора Rheoscan для оценки температурной зависимости САД, СДД, КСН в диапазоне температур от 20°С до 40°С. 3. Проведено сравнение результатов измерений и статистическая обработка результатов. Основные результаты WP2 представлены на рисунке 3. Схема оптической ловушки с температурной ячейкой показана на рисунке 3(а). Нами были измерены зависимости силы взаимодействия эритроцитов при температурах 20°С, 30°С и 38°С и пересчитаны в сдвиговые напряжения для сопоставления с результатами других агрегометров. Сила агрегации САД и СДД практически не изменялись от температуры (p<0,05) при измерении на ОЛ. Температурные зависимости КСН были измерены в диапазоне от 22 до 38 градусов для агрегометров с различной геометрией измерительного канала. Агрегометры с ячейкой Куэтта и конической пластиной показывали значения в 1,5 раза меньшие при увеличении температуры до 38 градусов, в то время как система с микроканальным потоком (RheoScan) давала постоянную величину (рис. 3(б)). Значения САД и СДД, измеренные ловушкой составляли 362 ± 157 мПа (22 ° С) и 312 ± 57 мПа (38 ° С) соответственно. Таким образом, нами было показано, что агрегометры с микроканальным потоком и ОЛ не имеют температурной зависимости при измерении параметров агрегации эритроцитов, в то время как измерения агрегационных параметров с использованием других приборов являются температурозависимыми. Температурная зависимость, наблюдаемая другими агрегометрами (отличными от прибора RheoScan), скорее всего, является проявлением особенности используемой геометрии измерительной камеры. Fig. 3. (a) Схема двухканальной ОЛ и экспериментальной ячейки, позволяющей устанавливать температуру с точностью ±0.5°С; (b) Результаты измерения (отмечены звездочками) в сравнении с температурной зависимостью КСД, измеренными разными геометриями, прикладывающими сдвиговое напряжение на клетки. Размер звездочки совпадает с погрешностью измерения. Результаты опубликованы в виде 2-х статгй в международный рецензируемый научный журнал Clinical Hemorheology and Microcirculation.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Оптическое исследование и клиническая верификация фундаментальных реологических механизмов обратимой агрегации эритроцитов
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".